細胞抗氧化活性方法在食物抗氧化活性評價中的研究進展

夏春燕，郭曉暉，李富華，陳 龍，趙國華,2，明 建,2,3,*

細胞抗氧化活性方法在食物抗氧化活性評價中的研究進展

夏春燕1，郭曉暉1，李富華1，陳 龍1，趙國華1,2，明 建1,2,3,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715； 2.西南大學 國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶 400715；3.農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶 400715)

由體內過剩自由基引起的心腦血管疾病和癌癥病人日漸增加，通過抗氧化物質的作用清除體內過量的自由基是減少此類疾病發生的最主要而有效的方法。大量研究證實，植物化學物質具有顯著的抗氧化作用，這些物質的最好來源是水果、蔬菜和谷物等，其在體內的抗氧化效果及活性評價是當前功能食品研究的熱點。細胞抗氧化活性(CAA)測定方法是目前建立起的能有效預測植物化學物質在生物系統中抗氧化活性的評價方法，被廣泛用于食物中抗氧化活性物質的功能評價。本文綜述國內外關于CAA測定方法及其在抗氧化功能食品評價中的研究進展。

細胞抗氧化活性；果蔬；谷物

由于抗氧化物質與促氧化物質的平衡失調而導致機體細胞長期處于氧化應激狀態，這種失調會導致細胞內大分子物質(如蛋白質、脂質、糖類、DNA)的積累性氧化損傷，加速人體細胞的衰老或病變。有研究[1]總結了體內氧化應激是誘導多種慢性疾病(心血管疾病和癌癥等)發生、發展的主要機制:體內(尤其是血液中)所載細胞外脂類物質被自由基氧化后，產生有毒性的氧化產物干擾細胞正常功能，從而引發炎癥(inflammation)，導致各種慢性疾病的發生。如心臟病是由高含量的低密度脂蛋白(LDL)導致高發生率的膽固醇氧化，產生高含量的膽固醇氧化產物改變了膽固醇新陳代謝有關細胞的功能，從而導致心血管板塊的形成。而流行病學研究證實，經常攝入富含抗氧化物質的食物(如果蔬、谷物等)可有效降低慢性疾病的發病幾率[2-4]。

食物抗氧化是指食物中的抗氧化活性成分(如多酚類植物化學物質及VA、VE、VC等)清除體內過多自由基或抑制自由基活動的作用。為了評價該作用的大小(即抗氧化活性的強弱)，研究者不斷建立起多種食物抗氧化的化學評價方法，這些體外的化學模型是評價植物化學氧化功能抑制體內毒性氧化產物和炎癥的一個重要指標。但已有的大部分研究中，反應介質通常只是針對某一類的植物化學物質的理化特性(如水溶性或脂溶性)做出抗氧化能力測定，而且不以易被自由基氧化與疾病密切相關的脂類為參照底物，所以結果很難與人體實際情況相比擬。最新研究用水脂乳狀液模擬人體生理體液作為化學模型介質，加自由基誘導膽固醇和脂肪酸氧化，很好地解決了這兩個問題，從而更可靠地判斷各類植物化學物質(如酚類化合物)的體內抗氧化和抗炎癥能力[5]。為了更能反映食物抗氧化劑在生理條件、細胞或體內產生的效應，應用細胞為基礎的抗氧化活性評價方法，如抗癌細胞增殖實驗，逐步得到采用。美國康奈爾大學劉瑞海教授率先建立了細胞抗氧化活性(cellular antioxidant activity，CAA)評價方法[6]。CAA方法以人體肝癌細胞HepG-2為實驗模型，觀察抗氧化物質在細胞中的反應情況，如抗氧化成分在細胞內的生物利用率、吸收和代謝情況，比傳統的化學方法更具有生物相關性，比動物模型和臨床研究更經濟、快捷，該方法的建立被認為是抗氧化劑研究方法中的革命。

1 細胞抗氧化活性方法的建立

20世紀90年代中期，隨著純化合物、食物和膳食補充劑的總抗氧化活性測定方法的建立，抗氧化活性評價方法得到了廣泛應用。抗氧化活性的評價方法分為體內(動物實驗)和體外(化學分析法)方法，后者主要包括Trolox當量的抗氧化能力(trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC)[7]、總氧自由基清除能力(total oxyradical scavenging capacity，TOSC)[8]、總自由基捕獲抗氧化參數 (total radical-trapping antioxidant parameter，TRAP)[9]、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)[10]、羥自由基清除能力(peroxyl radical scavenging capacity，PSC)[11]和氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)[12]等方法。這些方法在食物抗氧化活性評價中起到了非常重要的作用，但同時也存在一些缺陷:如DPPH方法易受光強度、氧濃度、溶劑類型[13]等條件影響，某些被測物與DPPH存在光譜重疊和反應可逆現象[14]；凡是能生成電子且電勢低于氧化還原對Fe(III)/Fe(II)的非抗氧化劑會影響FRAP方法的測定結果，某些抗氧化物質(如體內重要的抗氧化劑谷胱甘肽)不能還原Fe(III)，導致被測物質抗氧化活性被低估；TEAC法中產生的自由基不穩定，將低估抗氧化能力；ORAC方法的熒光指示劑對pH值敏感，pH＜7時熒光強度顯著降低[15]。

表1 細胞生物方法測定食品抗氧化活性的原理和應用Table 1 Principle and application of cell-based bioassays for food antioxidant activity

食物中往往含有多種抗氧化成分，不同的膳食成分之間會發生附加和協同效應[16]，化學方法通常只適用于幾種單一化學物質抗氧化活性的比較，難以評價整個食物的抗氧化效果；由于抗氧化活性物質往往會受到體內環境(如溫度、pH值、微生物等)的影響，其生物利用率和代謝又是研究抗氧化作用效果的重要問題[17](食物抗氧化成分之間的相互作用及食品加工等條件對其生物利用率有影響，且各成分消化吸收后的形式和活性都可能發生改變，導致最終表現出的總抗氧化活性也改變)。并且，化學抗氧化方法僅關注食物的抗氧化值，而沒有考慮到抗氧化成分在細胞內的生物利用率、吸收和代謝等情況，因此不能反映細胞生理條件[18]；此外，抗氧化劑的作用機理在預防疾病和促進健康的過程中遠不止是清除自由基，它還可通過抑制自由基產生或提高內源性抗氧化物質的水平來達到抗氧化效果，因而試管內進行的抗氧化實驗是非常單一的；動物模型和臨床研究是評估抗氧化劑體內實際效果較好的方法，但它們既昂貴又耗時，不適于大批量檢樣的初篩操作。于是一種新的抗氧化活性評價方法——基于細胞的生物方法，即CAA方法被建立起來并得到廣泛的應用和發展。

Eberhardt等[19-20]較早應用細胞培養來測定物質的抗細胞增殖活性，CAA實驗將抗氧化活性的評價提升到一個新的水平，是抗氧化研究領域的突破。繼CAA方法建立后，許多研究小組在CAA方法的基礎上建立了其他細胞模型(如Caco-2、RBC、AGS)的抗氧化活性評價方法，使細胞抗氧化方法得到豐富和發展，常用的測定食物中抗氧化活性的細胞生物方法主要有4種，其原理和應用見表1。

2 細胞抗氧化的原理與測定方法

2.1 CAA方法的基本原理

圖1 CAA方法原理[6]Fig.1 Principle of cellular antioxidant activity assay[6]

CAA方法的基本原理如圖1所示。細胞用抗氧化劑混合物(AOx)或水果提取物以及本身無熒光的指示劑混合物2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)預處理，抗氧化劑結合在細胞膜上并通過細胞膜進入細胞，DCFH-DA穿過細胞膜進入細胞內，細胞酯酶分解DCFH-DA形成極性更強的還原型二氯熒光素 (DCFH)。然后用2,2,-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽 (ABAP)處理細胞，ABAP分散在細胞中并自發分解形成過氧化自由基ROO*，這些過氧化自由基攻擊細胞膜產生更多自由基或活性氧(ROS*)。細胞內的DCFH極易被氧自由基或活性氧氧化成熒光物氧化型二氯熒光素 (DCH)，熒光物DCH可通過分光光度法測定。抗氧化劑可在細胞膜外部結合氧自由基而阻止其進入細胞，或者在細胞膜內部與ROS*和ROO*結合而阻斷DCFH氧化成DCF的過程，從而減少DCF的形成。CAA方法測定抗氧化劑阻止人體HepG-2癌細胞中ABAP產生的氧自由基導致DFC形成的能力，與對照組相比，細胞熒光物質的減少量就能反映該化合物的抗氧化能力。

2.2 CAA的操作方法

根據文獻[6,32-33]，總結了CAA的操作方法如下:測定前對肝癌細胞HepG-2進行傳代培養，VE培養基添加5%牛胎血清(PBS)、10mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、5μg/mL胰島素、0.05μg/mL皮質醇、50μg/mL青霉素、50μg/mL鏈霉素和100μg/mL慶大霉素，于37℃、5% CO2且具有較高濕度條件下培養，培養基每2～3d更換一次。

圖2 CAA方法流程圖Fig.2 Flow chart of cellular antioxidant activity assay

CAA方法流程如圖2所示，HepG-2細胞在96孔板上按6×104個/孔的密度接種，接種24h后除去培養基，用100μL PBS洗滌一次。用100μL含有不同濃度抗氧化物與25μmol/L DCFH-DA的溶液處理1h(37℃)。然后去除DCFH-DA，用100μL PBS洗滌一次。再用100μL 600μmol/L ABAP處理，最后用熒光酶標儀(538nm)每5min測一次熒光值，持續1h。每個平板上對照組用DCFH-DA和ABAP處理，空白組只用DCFH-DA處理。經過空白調零和熒光度初值調零后，可譜出熒光值隨時間的變化曲線，由曲線下的面積便可計算出抗氧化物質的CAA值，計算公式為CAA unit＝1－(∫SA/∫CA)。式中:∫SA為樣品熒光值相對于時間曲線下的完整面積；∫CA為對照組曲線下的完整面積。

CAA實驗中將槲皮素作為標準物，純植物化學物質的CAA值以mmol QE(槲皮素當量)/100μmol化合物表示，食物提取物的CAA值以mmol QE/100g食物表示。研究發現，CAA值與被測樣品的總酚含量緊密相關，CAA值可用于準確地反映總酚含量[6,34]。另外，CAA值可由EC50(半數有效量)按每100μmol純植物化學物質或100g樣品含多少μmol QE轉換而來，EC50越小，CAA值越高，抗氧化活性則越好。

3 細胞抗氧化方法的應用

細胞抗氧化測定方法往往通過抗細胞增殖能力來反映其體內抗氧化效果，主要用于食物如果蔬、谷物、豆類和純植物化學物質等的抗氧化活性的評價。

果蔬抗氧化活性成分是當前科學研究的熱點，國外研究者相繼從多種果蔬中提取并鑒定出抗氧化成分，并測定其抗氧化能力。Eberhardt等[20]對蘋果抑制Caco-2和HepG-2細胞增殖的能力進行了研究，結果表明，帶皮和去皮的蘋果水提物質量濃度各為50mg/mL時，對Caco-2的抑制率分別為(43±1)%和(29±4.1)%，對HepG-2的抑制率分別為(57±0.21)%和(40±0.64)%，說明帶皮蘋果的提取物較去皮蘋果的提取物抑制癌細胞增殖的能力強。進一步研究[35-38]表明，蘋果皮的提取物比蘋果果肉提取物抑制癌細胞增殖的能力更強，比較4個蘋果品種(Rome Beauty、Idared、Cortland、Golden Delicious)發現，Rome Beauty蘋果果皮提取物質量濃度在(12.4± 0.4)mg/mL時，能抑制50%的HepG-2細胞生長，具有相對較高的抑制癌細胞增殖能力[39]。Meyers等[40]研究發現，草莓的抗細胞增殖能力僅次于蘋果，8個不同品種的草莓提取物質量濃度各為50mg/mL時，對HepG-2癌細胞的抑制率分別為:Earliglow(8 9.1±0.9)%、Evangeline(88.7±0.7)%、Sable(86.1±5.0)%、Jewel (83.2±2.7)%、Sparkle(78.5±3.3)%、Mesabi(76.4± 1.7)%、Allstar(72.2±2.2)%、Annapolis(68.2±0.0)%。常見水果中，蔓越橘、檸檬、蘋果、草莓、葡萄、香蕉、桃子對HepG-2細胞增殖抑制的EC50值依次增加，即抑制細胞增殖的能力依次減弱[41]；常見蔬菜中，菠菜、大白菜、紅辣椒、洋蔥、花椰菜、土豆和甜菜的EC50值依次增加，即抑制HepG-2細胞增殖的能力依次減弱[42]。大量實驗證實，被測物的提取濃度與抑制細胞增殖的能力是存在劑量-效應關系的，濃度越大，抗增殖能力越強。Wolfe[33]、Song Wei[34]等測定了幾十種常見果蔬提取物的抗氧化活性，發現兩種不同處理方法(不用PBS和用PBS)測得蘋果的CAA值分別為(21.9± 4.0)μmol QE/100g和(17.2±2.0)μmol QE/100g，野生藍莓的CAA值分別為(292±11)μmol QE/100g和(74.1± 12.5)μmol QE/100g。漿果類一般具有較高的CAA值，如野生藍莓、草莓、黑莓、樹莓等，而瓜果類的CAA值較低，如哈密瓜等。蔬菜中則是甜菜、花椰菜和紅辣椒的CAA值較高。CAA值高低與總酚含量是密切相關的。

谷物中也含有酚酸、黃酮、單寧等酚類化合物，含量和種類與果蔬中的相當，與果蔬不同的是谷物中的酚大多是結合酚，很多實驗都證明谷物如有色稻米等具有抗氧化活性[43]。研究發現，米糠提取物對細胞HL-60和MOL-4的IC50值分別為2.3mg/kg和2.8mg/kg[44]。Hu Chun等[21]用RAW264.7細胞系證明了深藍色粒小麥的麥麩能使H2O2自由基氧化產生的熒光迅速減少，且存在劑量-效應關系。

CAA方法用于評價純植物化學物質的抗氧化活性時發現:具有3,,4,-O-二羥基、2,3雙鍵結合的4-酮基、3-羥基結構的類黃酮具有較高的CAA值[45]；不同純植物化學物質中，槲皮素的CAA值最高，山奈酚、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、楊梅酮、木犀草素次之[6]。以Wolfe等[45]的CAA方法以及Honzel等[46]的基于人體血紅細胞的CAP-e方法(cell-based antioxidant protection assay utilising erythrocytes)為基礎，Blasa等[31]建立了CAA-RBC方法(cellular antioxidant activity utilising red blood cells)，用該方法對各種純黃酮類物質進行分析，發現異鼠李素、楊梅酮、山奈酚表現出較高細胞抗氧化活性，而木犀草素、EGCG、白藜蘆醇、芹菜素和兒茶素表現出較低活性，與上述CAA方法的結果有一定差異。

此外，CAA方法在豆類[47]、咖啡[48]、茶葉(茶多酚)[49]等提取物的細胞抗氧化活性研究中也有應用。

4 結 語

細胞抗氧化實驗反映了抗氧化物質在細胞內的吸收、代謝和分布等方面，比化學抗氧化方法更具有生物相關性，能更好地預測物質在體內的抗氧化活性，目前被廣泛用于果蔬等食物細胞抗氧化活性的評價。細胞抗氧化實驗在評估其他各種抗氧化劑、具有抗氧化活性的食物和膳食補充劑上具有廣闊的應用前景。

細胞抗氧化實驗也面臨著一些挑戰。Girard-Lalancette等[29]實驗證明，大多數果蔬汁提取物(如胡蘿卜、花椰菜、桃子、草莓、藍莓)在質量濃度大于6.25mg/mL時能顯著增加DCF熒光的猝滅，因此測定物質抗氧化活性之前要先測定其對熒光的猝滅作用，否則不能準確評估抗氧化劑清除自由基的能力。實驗過程中，細胞用DCFH處理之前一般先用不含DCFH的溶液處理，因而細胞內的DCFH、DCF水平降低了，反之，細胞外的水平則增加了，這將在一定程度上影響實驗結果。細胞模型介質中很多對脂溶性植物化學不相溶的，一般都需要用二巰甲基過渡，因引入了不必要的干擾物質，影響了實驗結果，所以對照的做法很重要。CAA值與總酚或總抗氧化活性具有較強的相關性，比ORAC值更能預測總酚的含量，但體外細胞培養模式并不能完全代表抗氧化物質在生物體內的代謝和作用情況，因為不是任何植物化學物質經消化后都能被吸收進入人體肝臟細胞或到達上述的有關細胞，所以大部分細胞抗氧化實驗直接用提取物做細胞模型可能與人體的攝入含植物化學物質的食物后的實際情況有很大差別，一般先要經人體各種消化酶和消化條件降解后，或腸胃細菌酵解后再做細胞模型測試結果相對可靠。因此細胞抗氧化實驗面臨的最大挑戰就是將CAA的結果與體內方法(動物實驗)的結果相聯系，判斷其是否能預測體內實驗的結果。

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Research Progress of Cellular Antioxidant Activity Assay for Antioxidant Evaluation of Foods

XIA Chun-yan1，GUO Xiao-hui1，LI Fu-hua1，CHEN Long1，ZHAO Guo-hua1,2，MING Jian1,2,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. National Food Science and Engineering Experimental Teaching Center, Southwest University, Chongqing 400715, China；3. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation(Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

It is well known that increasing cardiovascular diseases and cancers were caused by excessive free radicals in vivo. Scavenging of excessive free radicals by antioxidants is one of the effective methods to reduce such diseases. Numerous studies have demonstrated that phytochemicals from fruits, vegetables and whole grains, possess strong antioxidant activity. Therefore, studies on antioxidant effects in vivo or antioxidant activity evaluation of these substances have become a hot topic in the field of functional foods. Cellular antioxidant activity (CAA) assay has been established and widely applied in antioxidant evaluation of functional foods, which can effectively predict the antioxidant activity of phytochemicals in biological system. In this paper, the current research progress of CAA in China and other countries and its application in antioxidant evaluation of functional foods are reviewed in this paper.

cellular antioxidant activity；fruits and vegetables；grains

TS201.2

A

1002-6630(2012)15-0297-06