超臨界CO2密度對(duì)全反式番茄紅素吸光系數(shù)的影響

何強(qiáng)強(qiáng)，惠伯棣，宮 平

超臨界CO2密度對(duì)全反式番茄紅素吸光系數(shù)的影響

何強(qiáng)強(qiáng)，惠伯棣*，宮 平

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院， 北京 100191)

目的:通過(guò)在超臨界CO2色譜上測(cè)定CO2流動(dòng)相密度與全反式番茄紅素組分峰面積的相關(guān)性，推算二氧化碳密度變化對(duì)全反式番茄紅素的吸光系數(shù)的影響。方法:超臨界色譜條件:色譜柱:Diamonsil C8(250mm× 4.6mm，5μm)；檢測(cè)波長(zhǎng):453nm；壓力變化范圍:11.5～17.5MPa；溫度變化范圍:35～55℃；流速: 2mL/min；進(jìn)樣量:20μL。結(jié)果:全反式番茄紅素組分在超臨界CO2中最大吸收波長(zhǎng)處的峰面積是可變的，與CO2密度呈線性正相關(guān)。結(jié)論:可推斷全反式番茄紅素吸光系數(shù)與超臨界CO2流體密度變化呈正相關(guān)。

全反式番茄紅素；超臨界流體色譜；超臨界CO2；密度；吸光系數(shù)

番茄紅素(lycopene)是一種胡蘿卜素(carotene)，系統(tǒng)命名為ψ,ψ-胡蘿卜素(ψ,ψ-carotene)，分子式為C40H56，相對(duì)分子質(zhì)量為536.85。番茄紅素的分子由多聚烯鏈構(gòu)成，含11個(gè)共軛雙鍵和2個(gè)非共軛雙鍵，末端無(wú)芳香環(huán)，為開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)。由于分子中存在多個(gè)雙鍵，番茄紅素普遍存在幾何異構(gòu)現(xiàn)象。天然來(lái)源的番茄紅素主要以全反式(all E-isomer)的形式存在(圖1)，是最穩(wěn)定的一種構(gòu)型。在目前的研究工作中，反式異構(gòu)體的性質(zhì)是關(guān)注的重點(diǎn)[1-4]。

超臨界流體是物質(zhì)處于臨界壓力和臨界溫度之上的一種狀態(tài)。超臨界流體技術(shù)(包括超臨界流體萃取和色譜)已被大量應(yīng)用于類(lèi)胡蘿卜素的制備和分析上[5-6]。由我國(guó)新疆紅帆生物科技有限公司研發(fā)的世界上第一條應(yīng)用超臨界CO2為第一萃取溶媒從番茄果皮中萃取天然番茄紅素的生產(chǎn)線在我國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)巴音郭楞蒙古自治州已經(jīng)運(yùn)行了6年[7]。以番茄紅素為功能因子的保健食品和食品添加劑產(chǎn)品在我國(guó)市場(chǎng)上呈暢銷(xiāo)趨勢(shì)。在這些應(yīng)用中，類(lèi)胡蘿卜素的檢測(cè)主要依靠其在紫外-可見(jiàn)區(qū)的吸收光譜(電子吸收光譜)。因此，研究超臨界流體溶媒對(duì)類(lèi)胡蘿卜素(尤其是番茄紅素)電子吸收光譜的影響具有十分現(xiàn)實(shí)的意義。

在這一領(lǐng)域的研究始于20世紀(jì)90年代初期，由惠伯棣等[8]報(bào)道。到目前為止，惠伯棣等[1,2,6,8]所報(bào)道的結(jié)果包括:1)在超臨界CO2中，番茄紅素和β-胡蘿卜素的最大吸收波長(zhǎng)較其在有機(jī)溶劑中的小；2)二者的最大吸收波長(zhǎng)與CO2密度呈正相關(guān)；3)二者的躍遷能與CO2的極化率呈負(fù)線性相關(guān)[9]。在方法上，由惠伯棣等進(jìn)行的番茄紅素在超臨界CO2流體中電子吸收光譜的研究工作均使用的是流動(dòng)檢測(cè)設(shè)備。與使用靜態(tài)電子吸收光譜收集設(shè)備的方法相比，這種方法所需的設(shè)備較為普及，一般耐高壓的液相色譜檢測(cè)器即可。所得數(shù)據(jù)重復(fù)性較好，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后具有較好的置信度。

本項(xiàng)研究的目的為:根據(jù)在超臨界CO2色譜上測(cè)定的CO2流動(dòng)相密度與全反式番茄紅素組分峰面積的相關(guān)性，推算CO2密度變化對(duì)全反式番茄紅素的吸光系數(shù)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DSM redivivoTM全反式番茄紅素樣品(番茄紅素含量≥10%) 瑞典帝斯曼公司。該產(chǎn)品為人工合成全反式番茄紅素的微結(jié)晶油懸浮物，含有少量的α-生育酚。使用前應(yīng)用UV-Vis法對(duì)其中總番茄紅素含量進(jìn)行標(biāo)定[10]，標(biāo)定含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.03%。隨后應(yīng)用C30-HPLCPDA對(duì)其幾何異構(gòu)體組成進(jìn)行了分析[4,11]。分析結(jié)果表明:該樣品中全反式異構(gòu)體的含量超過(guò)97%。

CO2(純度為99.9%) 北京氣體公司；乙腈、甲醇(色譜純) 美國(guó)迪馬公司；二氯甲烷、正己烷、N,N-二異丙基乙胺(分析純) 美國(guó)JK化學(xué)品公司。

1.2 儀器與設(shè)備

圖2 超臨界CO2流體色譜儀Fig.2 Flow chart of supercritical carbon dioxide fluid chromatography

超臨界流體色譜設(shè)備(該系統(tǒng)由CO2源、CO2泵、夾帶劑泵、進(jìn)樣器、紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器(具掃描功能)、尾壓閥及控制器和數(shù)據(jù)采集設(shè)備組成，詳見(jiàn)圖2)、HPLC設(shè)備(PU-2080 Plus智能輸送泵、CO2輸送泵PU-1580-CO2、尾壓控制器BP-1580-81、檢溫箱CO-2065 Plus)日本分光(Jasco)公司、N2000色譜數(shù)據(jù)工作站 浙大智達(dá)公司；Diamonsil C8色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)美國(guó)迪馬公司。Multi Spec-1501紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津公司；Waters PDA-2996二極管陣列檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的配制

將樣品在開(kāi)啟前置于40℃水浴中15min，并不時(shí)搖動(dòng)，使樣品具有一定流動(dòng)性。開(kāi)封后迅速稱(chēng)取0.1775g樣品于10mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容，制成0.01775g/mL的樣品儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液貯存于－80℃冰箱中，于48h內(nèi)使用完畢。根據(jù)各實(shí)驗(yàn)的需要用貯備液配制成不同質(zhì)量濃度的工作液。

1.3.2 色譜操作

1.3.2.1 超臨界流體色譜

由于樣品中番茄紅素的含量?jī)H為10%，因此，在采集組分的電子吸收光譜前，需經(jīng)過(guò)色譜的分離和純化過(guò)程，以確保組分在被收集光譜時(shí)處于純度較高的狀態(tài)。同時(shí)，在采集樣品組分的光譜時(shí)，組分的溶媒也必須單一，為超臨界態(tài)的CO2。否則，組分的吸光強(qiáng)度會(huì)受到干擾。因此，在采集光譜前，使用了C8固定相對(duì)組分進(jìn)行了超臨界流體色譜純化。組分的色譜純化及光譜采集過(guò)程操作如下:關(guān)閉閥門(mén)-2，打開(kāi)閥門(mén)-1，打開(kāi)氣瓶閥門(mén)。打開(kāi)C O2泵的制冷機(jī)電源，等待約30min，待綠色指示燈亮后，打開(kāi)所有設(shè)備的電源。設(shè)定柱溫箱溫度為45℃，開(kāi)啟反壓閥。約10min后，系統(tǒng)中空氣排盡。隨后，設(shè)定CO2泵的流速為2mL/min，反壓閥調(diào)控方式為恒流模式。在所有的實(shí)驗(yàn)中，樣品導(dǎo)入體積均為20mL。

在色譜柱載量測(cè)定中，設(shè)定壓力為13MPa，柱溫箱溫度為45℃。根據(jù)之前研究[8-9]，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為453nm。

在壓力變化研究中，設(shè)定壓力分別為11.5、13、14.5、16、17.5MPa，柱溫箱溫度為45℃。檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為453nm。樣品導(dǎo)入量為1.2μg。

在溫度變化研究中，設(shè)定壓力為13MPa，柱溫箱溫度分別為35、40、45、50、52℃。檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為453nm。樣品導(dǎo)入量為1.2μg。

1.3.2.2 高壓液相色譜

色譜條件:流速:0.7mL/min；溫度:室溫25℃；流動(dòng)相:乙腈-甲醇-二氯甲烷-正己烷-N-乙基-迪索丙胺(850:100:25:25:0.5，V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng):470nm；樣品導(dǎo)入量:1.2μg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

色譜系統(tǒng)在使用前用番茄紅素樣品進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試，6次進(jìn)樣中番茄紅素組分峰面積的RSD≤3%。在實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3次以上，直到采集到RSD小于3%的平行數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 全反式番茄紅素的超臨界CO2色譜行為

Jasco UV 2705 Plus Intelligent UV-Vis型檢測(cè)器具有進(jìn)行實(shí)時(shí)光譜掃描的功能。因此，全反式番茄紅素組分的超臨界CO2色譜行為如圖3所示。

圖3 全反式番茄紅素組分的超臨界二氧化碳色譜行為Fig.3 Supercritical carbon dioxide chromatographic profile of alltrans lycopene fraction

2.2 壓力變化對(duì)保留時(shí)間的影響

圖4 壓力變化對(duì)全反式番茄紅素組分保留時(shí)間的影響Fig.4 Effect of pressure on retention time of all-trans lycopene fraction

由圖4可知，當(dāng)CO2流動(dòng)相的壓力自11.5MPa升至17.5MPa時(shí)，全反式番茄紅素組分在453nm波長(zhǎng)處的保留時(shí)間呈縮短趨勢(shì)。

2.3 溫度變化對(duì)保留時(shí)間的影響

圖5 溫度變化對(duì)全反式番茄紅素組分保留時(shí)間的影響Fig.5 Effect of temperature on retention time of all-trans lycopene fraction

由圖5可知，當(dāng)CO2流動(dòng)相的溫度自32℃升至52℃時(shí)，全反式番茄紅素組分在13MPa壓力和453nm波長(zhǎng)處的保留時(shí)間呈延長(zhǎng)趨勢(shì)。

2.4 密度變化對(duì)保留時(shí)間的影響

由于超臨界CO2流體的壓力和溫度變化會(huì)引起其密度的變化，可根據(jù)全反式番茄紅素組分在453nm波長(zhǎng)處的保留時(shí)間與CO2壓力和溫度變化的相關(guān)性(圖4、5)，得到組分保留時(shí)間與CO2密度變化的相關(guān)性(圖6)。

圖6 CO2密度變化對(duì)全反式番茄紅素組分保留時(shí)間的影響Fig.6 Effect of carbon dioxide density on retention time of all-trans lycopene fraction

2.5 色譜柱的最小檢測(cè)限、載量與線性測(cè)定

在壓力為13MPa、溫度為45℃、流速為2mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)為453nm、進(jìn)樣體積為20μL時(shí)，本色譜系統(tǒng)的全反式番茄紅素最小檢出量為60ng。

本項(xiàng)研究的目的是在色譜系統(tǒng)上根據(jù)組分的峰面積推算全反式番茄紅素的吸光系數(shù)，并觀察色譜流動(dòng)相條件的變化對(duì)吸光系數(shù)的影響。因此，樣品進(jìn)樣量與組分峰面積的線性相關(guān)是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件。由圖7可知，當(dāng)樣品量在0～11.836μg時(shí)，樣品進(jìn)樣量與組分峰面積可以被認(rèn)為呈線性相關(guān)(R2＝0.9967)。色譜柱的載量值＞15μg。

圖7 樣品進(jìn)樣量對(duì)全反式番茄紅素組分峰面積的影響Fig.7 Effect of sample loading amount on fraction peak area

2.6 壓力變化對(duì)峰面積的影響

圖8 壓力變化對(duì)全反式番茄紅素組分峰面積的影響Fig.8 Effect of pressure on fraction peak area

在以下的實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)樣量均為1.2μg，小于色譜柱的載量，以保證樣品量與組分峰面積的線性關(guān)系。由圖8可知，當(dāng)CO2流動(dòng)相的壓力自11.5MPa升至17.5MPa時(shí)，全反式番茄紅素組分在453nm波長(zhǎng)的峰面積呈增加趨勢(shì)。

2.7 溫度變化對(duì)峰面積的影響

圖9 溫度變化對(duì)全反式番茄紅素組分峰面積的影響Fig.9 Effect of temperature on fraction peak area

由圖9可知，當(dāng)CO2流動(dòng)相的溫度自32℃升至55℃時(shí)，全反式番茄紅素組分在453nm波長(zhǎng)的峰面積呈減少趨勢(shì)。

2.8 CO2密度變化對(duì)峰面積的影響

如上所述，超臨界CO2流體的壓力和溫度變化可引起其密度的變化。根據(jù)全反式番茄紅素組分在453nm波長(zhǎng)處的峰面積與CO2流動(dòng)相壓力和溫度變化的相關(guān)性(圖8、9)，其峰面積與CO2密度變化的相關(guān)性見(jiàn)圖1 0。

圖10 CO2密度變化對(duì)全反式番茄紅素組分峰面積的影響Fig.10 Effect of CO2 density on fraction peak area

由圖10可知，在0.53～0.75g/mL范圍內(nèi)，當(dāng)超臨界CO2密度增加時(shí)，其中全反式番茄紅素組分的峰面積呈增加趨勢(shì)。本項(xiàng)研究所得數(shù)據(jù)表明:關(guān)于超臨界CO2密度與組分峰面積的數(shù)量相關(guān)性尚不能確定。但在這個(gè)密度范圍內(nèi)，其R2＝0.9075。如要確定二者的關(guān)系，需擴(kuò)大檢測(cè)密度的范圍。即使如此，在本項(xiàng)研究中，亦可根據(jù)所得二者的線性關(guān)系推算了在不同CO2密度條件下的全反式番茄紅素組分吸光系數(shù)。

2.9 全反式番茄紅素組分在HPLC流動(dòng)相中的吸光系數(shù)測(cè)定與計(jì)算

在本項(xiàng)研究中，也對(duì)1.2μg全反式番茄紅素組分在乙腈為主的流動(dòng)相(乙腈體積分?jǐn)?shù)85%)中的峰面積進(jìn)行了測(cè)定。隨后，在UV-Vis上，根據(jù)惠伯棣等[8]報(bào)道的方法，測(cè)定了該組分在流動(dòng)相中的值為3430。

雖然根據(jù)本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，超臨界CO2密度與組分峰面積的數(shù)量相關(guān)性尚不能確定。但在這個(gè)密度范圍內(nèi)，線性回歸方程為:

式中:x為超臨界CO2密度/(g/mL)；y為全反式番茄紅素組分峰面積/(mV·s)。

其中:R2＝0.9075。在本項(xiàng)研究中，根據(jù)所回歸的線性關(guān)系按式(2)推算全反式番茄紅素組分在密度為0.53～0.75g/mL范圍內(nèi)超臨界CO2流體中的吸光系數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。

式中:ASF為全反式番茄紅素組分在超臨界CO2流體中的吸光系數(shù)AHPLC為全反式番茄紅素組分在HPLC流動(dòng)相中的吸光系數(shù)(A)；SSF為全反式番茄紅素組分在超臨界CO2流體中的峰面積/(mV·s)；SHPLC為全反式番茄紅素組分在H PLC流動(dòng)相中的峰面積/(mV·s)。

表1 溶媒密度變化對(duì)全反式番茄紅素吸光系數(shù)化的影響Table 1 The influence of variation in medium density on variation in all E-lycopene absorption coefficient

表1 溶媒密度變化對(duì)全反式番茄紅素吸光系數(shù)化的影響Table 1 The influence of variation in medium density on variation in all E-lycopene absorption coefficient

溶媒名稱(chēng)密度/(g/mL)吸光系數(shù)(A1cm)狀態(tài)HPLC流動(dòng)相0.7903430液態(tài)0.7572238超臨界態(tài)0.7502221超臨界態(tài)0.7272165超臨界態(tài)超臨界CO20.6992098超臨界態(tài)0.6912078超臨界態(tài)0.6441964超臨界態(tài)0.5861823超臨界態(tài)0.5781804超臨界態(tài)1%

3 結(jié) 論

本項(xiàng)研究的結(jié)果表明:全反式番茄紅素組分在超臨界CO2色譜中最大吸收波長(zhǎng)下的峰面積是可變的，與CO2密度呈線性正相關(guān)。由此，可以得出結(jié)論:全反式番茄紅素的吸光系數(shù)與超臨界CO2流體密度變化呈線形正相關(guān)。

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Effect of Supercritical Carbon Dioxide Density on Absorption Coefficient of All-trans Lycopene

HE Qiang-qiang，HUI Bo-di*，GONG Ping (College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective: To assess the effect of varying carbon dioxide density on absorption coefficientof all-trans lycopene through exploring the correlation between carbon dioxide density in supercritical fluid chromatography (SFC) and peak areas of all-trans lycopene fractions. Methods: Supercritical CO2fluid chromatography was carried out on a Diamonsil C8(250mm × 4.6 mm, 5 μm, ) at a pressure ranging from 11.5 to 17.5 MPa, and a temperature ranging from 35—55 ℃. The detection wavelength was 453 nm, and 20 μL sample was injected for SFC chromatography. Results: Peak area of all-trans lycopene at the maximum absorption wavelength in supercritical carbon dioxide fluid chromatography revealed a variation and was linearly positive correlated with the density of carbon dioxide. Conclusion: Absorption coefficient of all-trans lycopene is positively correlated with the density of supercritical carbon dioxide.

all-trans lycopene；supercritical fluid chromatography (SFC)；supercritical carbon dioxide；density；absorption coefficient

TS207.3

A

1002-6630(2012)15-0052-05

2011-07-04

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BAI58B06)；2010年北京聯(lián)合大學(xué)“創(chuàng)新人才建設(shè)計(jì)劃”項(xiàng)目(2010-05-20)

何強(qiáng)強(qiáng)(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)制備及天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail:8075874@163.com

*通信作者:惠伯棣(1959—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)轭?lèi)胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)。E-mail:bodi_hui@ygi.edu.cn