芍藥苷對過氧化氫誘導SH-SY5Y細胞PCNA及Caspase-3表達的影響

周 潔，曹鵬濤，馮凱祥，賈巖巖，羅雪婷，潘夢音，溫新麗，于甜甜，楊五彪

·基礎醫學·

芍藥苷對過氧化氫誘導SH-SY5Y細胞PCNA及Caspase-3表達的影響

周 潔，曹鵬濤，馮凱祥，賈巖巖，羅雪婷，潘夢音，溫新麗，于甜甜，楊五彪

目的探討芍藥苷對過氧化氫（H2O2）誘導SH-SY5Y氧化損傷的保護作用及其可能機制。方法MTT法測定細胞存活率，細胞免疫化學技術檢測細胞細胞核增殖抗原（PCNA）、Caspase-3的表達。結果0.87 mmol／L H2O2可使細胞存活率降低，PCNA的表達減少，Caspase-3的表達增加。經過39μg／m L和62.5μg／m L濃度的芍藥苷處理后，H2O2誘導的SH-SY5Y細胞存活率明顯升高，PCNA的表達明顯增加，同時抑制Caspase-3的表達。結論芍藥苷可抑制過氧化氫誘導的SH-SY5Y細胞凋亡，其作用機制可能與其增加細胞PCNA的表達，減少Caspase-3的表達有關。

芍藥苷；過氧化氫；SH-SY5Y細胞；凋亡

凋亡是神經細胞死亡的主要機制，而且病灶周圍都要產生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）。細胞內ROS累積、線粒體膜電位（MMP）下降是氧化應激誘導細胞凋亡、引起細胞損傷的關鍵因素［1］，因此可以把減輕氧化應激作為藥物作用的靶點之一，用于神經保護藥物的篩選。芍藥苷（paeoniflorin，PF）具有抗自由基損傷，提高用于清除ROS的抗氧化物活性及降低MDA水平，對D-半乳糖和亞硝酸鈉誘導的神經元損傷具有保護作用［2］。本文用H2O2造成人神經母細胞瘤細胞株（SH-SY5Y）細胞凋亡模型，觀察不同濃度芍藥苷對SH-SY5Y細胞的抗凋亡效果，以探討芍藥苷對神經元細胞保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑芍藥苷（西安昊軒生物科技有限公司，批號：20110518，純度為98%），四唑鹽（MTT），小牛血清、DMEM（Gibco BRL公司）。

1.2 細胞培養及藥物處理人神經母細胞瘤細胞株（SH-SY5Y）（中國科學院上海細胞生物學研究所）。細胞用含2 mmol／L谷氨酰胺和10%小牛血清的DMEM培養基，在37℃5%CO2培養箱中培養。隔天傳代細胞，當傳代細胞在倒置顯微鏡下觀察均勻貼壁生長時，可用于實驗研究。

1.3 M TT法檢測H2O2對SH-SY5Y細胞的損傷作用將生長狀態良好的SH-SY5Y細胞以1×104細胞／孔接種于96孔板，待細胞貼壁。細胞貼壁后棄去培養液，每孔加含不同濃度H2O2的培養液200 μL。陰性對照組加不含H2O2的培養液200μL。繼續培養44 h每孔加入5 mg／m L MTT溶液20μL，繼續培養4 h后棄去培養液，每孔加入200μL DMSO，震蕩5 m in后酶標儀檢測490 nm處每孔的吸光度（OD）值。細胞存活率＝給藥組OD值／陰性組OD 值×100%。Orgin軟件計算半數抑制率（IC50）。

1.4 M TT法測定PF對H2O2、SH-SY5Y細胞損傷的保護作用取對數生長期的SH-SY5Y細胞，以1 ×104細胞／孔接種于96孔板，待細胞貼壁。細胞貼壁后模型組以0.87 mmol／L H2O2作用于SH-SY5Y細胞。治療組分別以不同濃度PF和0.87 mmol／L H2O2作用于SH-SY5Y細胞。治療組PF以7.8～1 000μg／m L作用于SH-SY5Y細胞。對照組只加SH-SY5Y細胞，不加藥物。細胞給藥44 h每孔加20 μL濃度為5 mg／m L的MTT溶液。繼續培養4 h后棄去培養液，每孔加入200μL DMSO，震蕩5 m in后酶標儀490 nm處檢測吸光度值（OD）。檢測方法同方法1.3。

1.5 細胞免疫化學技術檢測細胞PCNA、Caspase-3的表達取對數生長期SH-SY5Y細胞消化制備細胞懸液，調整細胞濃度為1×104／m L，接種于內置無菌玻片的9孔板內（2 m L／孔）。培養24 h后，分6組，芍藥苷終濃度分別為39和62.5μg／m L，對照組不加藥物。以上各組平行3孔，繼續培養48 h后，爬片用PBS漂洗2遍，經4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌后自然風干。檢測方法按免疫組化試劑盒說明書進行。

1.6 統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。測定值以±s表示，組間比較用t檢驗。

2 結果

2.1 過氧化氫及芍藥苷對SH-SY5Y細胞存活率的影響 MTT分析表明，0～6.0 mmol H2O2的處理48 h，呈濃度依賴性地降低SH-SY5Y細胞的存活率。而H2O2對SH-SY5Y細胞IC50為0.87 mmol／L，見圖1和圖2。

2.2 SH-SY5Y細胞PCNA、Caspase-3的表達結果PCNA表達于細胞核中，而Caspase-3表達于細胞質中，染色陽性信號呈棕黃色。與空白組相比，模型組SH-SY5Y細胞PCNA的表達明顯減少，Caspase-3的表達明顯增多；芍藥苷組PCNA表達顯色則較模型組明顯增強，呈強陽性染色，且陽性細胞數明顯增加，Caspase-3的表達明顯減少。見圖3和圖4。應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡［6］。芍藥苷具有免疫調節、鎮痛、保肝、抗腫瘤、抗炎、改善學習記憶行為等作用，研究發現，芍藥苷對神經元的生長存活具有促進作用，并可顯著提高多種鈣超載損傷模型中的大鼠神經細胞的存活數［7］。

圖1 不同H2O2濃度對細胞存活率的影響

圖2 芍藥苷抗H2O2誘導SH-SY5Y細胞細胞毒性

圖3 芍藥苷對H2O2誘導SH-SY5Y細胞PCNA表達的影響

圖4 芍藥苷對H2O2誘導SH-SY5Y細胞Caspase-3表達的影響

本文以H2O2處理SH-SY5Y細胞，制備氧化應激損傷模型，探討PF對過氧化氫誘導SH-SY5Y細胞凋亡的抗氧化作用。本實驗結果顯示，PF可以減輕H2O2誘導的SH-SY5Y細胞毒性作用，而在39～312.5 μg／m L范圍內呈濃度依賴性的抑制H2O2引起的細胞毒性作用明顯提高細胞的存活率，提示PF具有神經細胞保護作用，能對抗H2O2引起的細胞凋亡。H2O2損傷后SH-SY5Y細胞核增殖因子PCNA的表達則明顯減少，Casepase-3的表達明顯增加，而PF能明顯促進PCNA表達，同時抑制Casepase-3的表達。PF具有抗氧化應激損傷的效應，增加了細胞的存活率，同時明顯促進PCNA表達，抑制Casepase-3的表達，為進一步研究芍藥苷的神經保護作用提供了依據。

3 討論

近年來，氧化應激被認為是一些神經退行性疾病、帕金森綜合征以及多發性硬化癥等嚴重危害人類健康疾病的主要原因。其中活性氧在神經退行性疾病的發病過程中扮演著舉足輕重的角色，腦組織的氧化代謝率很高，過氧化氫酶活性低，比其他部位更容易受到活性氧作用的影響。氧化應激誘發的自由基損傷是導致神經元凋亡的基本原因之一，因此抗氧化是保護神經元的有效途徑。

H2O2是氧化應激反應密切相關的活性氧之一，其主要產物具有很強的氧化性并可自由進入細胞，在許多神經元細胞培養模型中可引起細胞損傷，且許多中樞神經系統疾病都涉及到氧化應激損傷［3－4］。增殖細胞核抗原（PCNA）是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，參與調節DNA的合成，與細胞的增殖周期密切相關。PCNA是伴隨細胞增殖而表達的一種核內蛋白，可作為一項評估細胞增殖狀態的指標［5］。Casepase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Casepase-3為關鍵的執行分子，與DNA斷裂、染色質凝聚和凋亡小體形成有關。Casepase-3在正常狀態下以酶原的形式存在于胞漿中，沒有活性，但在細胞發生凋亡階段，它被激活，活化的Casepase-3由兩個大亞基和兩個小亞基組成，它可以水解多聚ADP核糖多聚酶（PARP），裂解相

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［2］ 李喬，鐘樹志，馬世平.芍藥苷對D-半乳糖和亞硝酸鈉誘導的大鼠認知障礙與神經元變性的改善作用［J］.藥學與臨床研究，2009，17（3）：172－174.

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［7］ 姜淼，禹良艷，卞慧敏.芍藥苷對KCL誘導原代培養大鼠皮層神經元損傷的保護作用［J］.中國中醫急癥，2009，18 （6）：937－939.

Effect of Paeoniflorin on Exp ression of PCNA and Caspase-3 in Peroxide-induced SH-SY5Y Cells

ZHOU Jie，CAO Peng-tao，FENG Kai-xiang，et al
（Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

ObjectiveTo study the protective effect of paeoniflorin（PF）on hydrogen peroxide（H2O2）-induced oxidative injury in SH-SY5Y.MethodsTo measure the cell viability of SH-SY5Y with MTT assay，the expression of PCNA and Caspase-3 was determined with immunohistochemicalmethod.Results0.87 mmol／L H2O2could significantly induce oxidative injury of SH-SY5Y cell viability，decrease the expression of PCNA，increase the expression of Casepase-3.In the presence of 39，62.5μg／m L PF，H2O2-induced cell viability was increased.With immunocytochem ical analysis，a up-regulation PCNA expression and a down-regulated Caspase-3 expression was observed.ConclusionPF could protect against H2O2－induced SH-SY5Y cell apoptosis，which mechanism is correlated with PCNA up-regulation and Caspase-3 down-regulation.

peoniflorin；hydrogen peroxide；SH-SY5Y cell；apoptosis

R774

A

1672－688X（2012）04－0241－03

國家自然科學基金項目（31171256）

河南省醫學科技攻關項目（201003079）

河南科技大學大學生研究訓練計劃項目（2012192）

2012－10－12

河南科技大學醫學院，河南洛陽471003

周潔（1991－），女，河南陜縣人，臨床醫學2010級在讀本科生。

楊五彪，男，教授，E-mail：ywbiao＠mail.haust.edu.cn