小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞脂向分化過程中miRNA-143的表達(dá)

凌宏艷，胡小波，奉水東，楊絲絲，何劍琴，張愷芳，廖端芳

（南華大學(xué)1.生理學(xué)教研室;2.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室;3.流行病學(xué)教研室，湖南衡陽 421001;4.湖南中醫(yī)藥科大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410208）

小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞脂向分化過程中miRNA-143的表達(dá)

凌宏艷1，胡小波2，奉水東3，楊絲絲1，何劍琴1，張愷芳1，廖端芳4*

（南華大學(xué)1.生理學(xué)教研室;2.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室;3.流行病學(xué)教研室，湖南衡陽 421001;4.湖南中醫(yī)藥科大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410208）

目的 探討小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）脂向分化過程中miRNA-143（miR-143）的表達(dá)，為闡明MSCs脂向分化的調(diào)控機(jī)制提供新線索。方法 采用全骨髓體外分離結(jié)合差速貼壁法純化擴(kuò)增C57BL/6小鼠MSCs，將第5代MSCs采用脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑進(jìn)行成脂誘導(dǎo)。運(yùn)用miRNA芯片技術(shù)比較MSCs組和脂肪細(xì)胞組中miR-143的表達(dá)，并通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證。結(jié)果 成功分離、純化和培養(yǎng)MSCs;MSCs經(jīng)脂肪誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，胞內(nèi)大量脂滴形成，油紅O染色陽性。MiRNA芯片及實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果均表明miR-143在MSCs脂向分化過程中顯著上調(diào)（3.73±0.42 vs 1.00±0.14，P＜0.01）。結(jié)論 miR-143可能參與調(diào)控MSCs的脂向分化。

miRNA-143;間充質(zhì)干細(xì)胞;脂向分化;miRNA芯片;實(shí)時(shí)定量PCR

*通信作者（corresponding author）:dfliao@yahoo.com.cn

脂肪組織工程概念的提出為軟組織缺損的修復(fù)與重建提供了全新的治療途徑，已成為組織工程研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一［1］。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesechymal stem cells，MSCs）是一小群存在于骨髓中的非造血細(xì)胞，具有高度的自我更新和多向分化潛能，在適宜的條件下可誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞等［2］，這些特點(diǎn)使得它成為組織工程理想的種子細(xì)胞。微小RNA（miRNA）是新近證明的一類高度保守的、內(nèi)源性非編碼的長(zhǎng)度為20～25 nt的RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［3］。研究表明miR-143參與人類前脂肪細(xì)胞和小鼠3T3-L1細(xì)胞分化過程［4－5］，但 miR-143 是否參與 MSCs成脂分化過程，目前仍不清楚，為此本研究采用miRNA芯片結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)MSCs脂向分化過程中miR-143的表達(dá)變化進(jìn)行觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco公司），分化誘導(dǎo)劑1-甲基-3-異丁基黃嘌呤（1-methyl-3-isobuthylxanthine，IBMX）、胰島素、吲哚美新、地塞米松（dexamethasone，Dex）及油紅O（均為Sigma公司）。

1.2 小鼠骨髓MSCs分離和原代培養(yǎng)

取清潔級(jí)6～8周齡雄性C57BL/6小鼠10只［體質(zhì)量18～24 g，由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SYXK（湘）2004-0011］，頸部脫臼處死，用75%乙醇浸泡1min，放置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)移入超凈工作臺(tái)，在裝有PBS液的培養(yǎng)皿內(nèi)將骨表面附有的肌肉及肌筋膜等清除干凈，再用20 mL的PBS清洗1次，移入裝有20 mL含 10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L的L-DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，將股骨和脛骨用鑷子輕輕夾起，將其兩端干骺端切除，顯露骨髓腔，用一次性10 mL注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM將骨髓沖出，直至整根骨發(fā)白為止。收集細(xì)胞混合液于室溫下以1 000 r/min，離心5 min;棄上清液及脂肪層，取細(xì)胞沉淀。向細(xì)胞沉淀中緩慢加入含10%FBS的L-DMEM，吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)有核細(xì)胞，將細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的濃度接種于 6孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每隔2天半量換液1次，用倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并照相記錄。

1.3 小鼠MSCs誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞

分別將傳至5～7代的小鼠MSCs按2×105/mL濃度接種于6孔板，細(xì)胞達(dá)到完全匯合后，加入脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液（含1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L胰島素、100 mmol/L吲哚美新、10%FBS的 DMEM 培養(yǎng)液）2 mL，誘導(dǎo)3 d，再用含10 μg/mL胰島素、10%FBS的 DMEM 培養(yǎng)液處理1 d，如此循環(huán)3次后，用含10 mg/L胰島素、10%FBS的DMEM培養(yǎng)液處理7～9 d，每隔3～4 d換液1次。

1.4 油紅O染色

誘導(dǎo)3周后細(xì)胞用PBS洗滌3次，每次5 min，60%異丙醇固定15 min，油紅O染色10 min，蒸餾水沖洗3次，每次1 min，蘇木素淺染核，1%鹽酸水稍分色及返藍(lán)后，水性封片劑封片。顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)被特異性的染為紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，染色后觀察并拍照。

1.5 miRNAs基因芯片實(shí)驗(yàn)

miRNA基因芯片表達(dá)譜檢測(cè)采用丹麥Exiqon公司8.0版的小鼠miRNAs芯片。Exiqon公司8.0版的芯片上固定的探針包括與人（328個(gè)）、小鼠（274個(gè)）、大鼠（238個(gè)）miRNAs精確配對(duì)的探針、對(duì)照探針以及錯(cuò)配探針，可以檢測(cè)Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫8.0版中所有已知的人、小鼠、大鼠和其他物種的miRNAs。本實(shí)驗(yàn)中分別用TRIZOL處理MSCs和MSCs來源的脂肪細(xì)胞，由上海康成生物公司進(jìn)行miRNA芯片雜交。基因表達(dá)譜芯片的檢測(cè)步驟包括總RNA的提取與鑒定、miRNA標(biāo)記及miRNA芯片雜交等步驟，最后芯片掃描獲得TIFF圖后，使用Genepix Pro 6.0軟件分析數(shù)據(jù)，以芯片中的內(nèi)對(duì)照熒光值為參照，分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的比值。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證miRNA芯片結(jié)果

從MSC和脂肪細(xì)胞中提取總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用LightCycler定量PCR儀（Bio Rad公司）進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，所有反應(yīng)均重復(fù)3次。實(shí)時(shí)定量PCR引物應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。miR-143引物序列:上游:5'-TGAGATGA AGCACTGTAGCTC-3'，下游:5'-GCGAGCACAGAA TTAATACGAC-3'，同時(shí)以U6 snRNA作為內(nèi)參基因，上游為5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，下游5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反應(yīng)條件:95℃5 min，40 個(gè) PCR 循環(huán)（95℃ 10 s，60℃ 1 min）。按照據(jù)公式 2－ΔΔCt計(jì)算相對(duì)的 miRNA 基因表達(dá)［6］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠MSCs形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)細(xì)胞剛接種時(shí)混有較多的單個(gè)核細(xì)胞，原代培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈圓形，折光性強(qiáng)（圖1A）。換液后懸浮細(xì)胞減少，細(xì)胞零星貼壁，呈梭形，連續(xù)換液3～4次后，無懸浮細(xì)胞存在，貼壁細(xì)胞增多，成旋渦狀生長(zhǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)8～10 d后，消化傳代，傳代細(xì)胞貼壁較快，剛傳代的細(xì)胞呈圓形;2 h后細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞形態(tài)由圓形向梭形轉(zhuǎn)化;24 h后開始增殖，細(xì)胞集落增多，5 d后可傳代，第5代以后，細(xì)胞形態(tài)趨于一致，基本上未見雜細(xì)胞（圖1B）。

圖1 MSCs的形態(tài)Fig 1 Morphology of MSCs（×4）

2.2 小鼠MSCs誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞

MSC誘導(dǎo)后第5天無明顯脂滴出現(xiàn)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，含胞內(nèi)脂滴逐漸增多，細(xì)胞體積逐漸增大，由原來的長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形或多角形，到誘導(dǎo)分化的21 d，大多數(shù)MSC均誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞。油紅O染色可見脂肪細(xì)胞中含大小不等的脂肪滴，細(xì)胞核被脂滴擠于細(xì)胞一側(cè)，脂滴被染成橙紅色，胞核為藍(lán)色（圖2）。

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的形態(tài)Fig 2 Morphology of adipocytes differentiated from MSCs（×40）

2.3 miRNAs基因芯片雜交結(jié)果

miR-143在MSCs來源的脂肪細(xì)胞和MSCs中表達(dá)水平分別為6.193和0.882（比值為7.02），結(jié)果顯示miR-143顯著上調(diào)。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果

脂肪細(xì)胞組miR-143的相對(duì)表達(dá)量為3.73±0.42，與對(duì)照MSCs組（1.00±0.14）相比顯著上調(diào)（P＜0.01），與miRNA芯片結(jié)果相一致。

3 討論

MiRNA是一類新近發(fā)現(xiàn)的單鏈小分子RNA，在生物體生長(zhǎng)、發(fā)育和疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用［3，7－8］。研究發(fā)現(xiàn) miRNA 除參與 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化外［4－5，9－10］，還參與胚胎干細(xì)胞分化過程［11］，提示miRNA也可能參與MSCs成脂分化。由于MSCs具有較強(qiáng)的黏附性，本研究采用貼壁篩選法分離MSCs，通過傳代得以擴(kuò)增和純化，最終變成形態(tài)均一的梭型樣細(xì)胞。隨后將該細(xì)胞用IBMX、地塞米松、吲哚美辛和胰島素處理21 d，通過油紅O染色發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)脂肪細(xì)胞表型。由此證實(shí)本研究分離出來的細(xì)胞是MSCs，且MSCs成功誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞，為下一步miRNAs芯片實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

盡管已有研究報(bào)道m(xù)iR-143可促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化［4－5］，且 ERK5 可能是 miR-143 的靶基因之一［4］。但由于脂肪細(xì)胞來源于MSCs定向分化，且目前暫未見MSCs脂肪分化中miRNA變化的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為了更清楚全面了解miRNA對(duì)脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控情況，本研究利用miRNA芯片高通量、高敏感性的特點(diǎn)，采用熒光標(biāo)記的miRNAs直接與miRNAs檢測(cè)芯片雜交，觀察MSCs脂向分化過程中miR-143表達(dá)。結(jié)果顯示，小鼠MSCs分化成脂肪細(xì)胞后miR-143顯著上調(diào)。隨后通過實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與 miRNA芯片一致，提示miR-143可能參與MSCs成脂分化，其具體作用機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

總之，本研究運(yùn)用miRNAs芯片結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，證明了miR-143與MSCs的脂向分化密切相關(guān)，為下一步研究miRNA在MSCs脂向分化中的作用及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為闡明MSCs脂向分化的分子調(diào)控機(jī)制提供了新的線索，為促進(jìn)脂肪組織工程的發(fā)展及軟組織損傷修復(fù)與重建的臨床運(yùn)用提供依據(jù)。

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The expression of miRNA-143 during adipogenic differentiation of mouse MSCs

LING Hong-yan1，HU Xiao-bo2，F(xiàn)ENG Shui-dong3，YANG Si-si1，HE Jian-qin1，ZHANG Kai-fang1，LIAO Duan-fang4*

（1.Dept.of Physiology;2.Dept.of Biochemistry and Molecular Biology;3.Dept.of Epidemiology，University of South China，Hengyang 421001;4.School of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

ObjectiveTo investigate the expression of miR-143 during adipogenic differentiation of mesechymal stem cells（MSCs）in mice，and provide new clues to clarify the regulation mechanisms of MSCs'adipogenic differentiation.MethodsThe MSCs of C57BL/6 mice were isolated，cultured by using the whole bone marrow method，amplified by the differential adherent method，and adipogenic differentiation of the fifth generation of MSCs was induced with the adipogenic medium.We used the microRNA microarray to explore the expression of miR-143 in the MSCs group and adipocytes group，and validated it by real-time quantitative polymerase chain reaction（real-time PCR）.ResultsWe got high-purity MSCs and Oil O staining showed that lipid droplets were increased in MSCs treated with adipogenic conditions.The miR-143 was up-regulated during adipogenic differentiation showed by microRNA microarray analysis and confirmed by using real-time PCR（3.73±0.42 vs 1.00±0.14，P ＜0.01）.ConclusionsMiRNA-143 may regulatie the adipogenic differentiation of MSCs.

miR-143;mesenchymal stem cells;adipogenic differentiation;microRNA microarray;real-time PCR

R 329.28;R 318;R 587.1

A

1001-6325（2012）01-0012-04

2011－03－21

2011－07－20

國(guó)家自然科學(xué)基金（81000328，30971170）;南華大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金（2010XQD39）