PTEN/Akt/mTOR通路增加K562/ADM細胞化療敏感性

成志勇，王素云，卞永生，溫省初，楊 寧，高曉麗，韓 英，潘 崚

（1.保定市第一醫院血液腫瘤科，河北保定 071000;2.河北省人民醫院血液內科，河北石家莊 050051;3.華西醫科大學華西醫院血液內科，四川成都 610041）

PTEN/Akt/mTOR通路增加K562/ADM細胞化療敏感性

成志勇1*，王素云2，卞永生1，溫省初1，楊 寧1，高曉麗1，韓 英1，潘 崚3

（1.保定市第一醫院血液腫瘤科，河北保定 071000;2.河北省人民醫院血液內科，河北石家莊 050051;3.華西醫科大學華西醫院血液內科，四川成都 610041）

目的 探討K562/ADM細胞系中PTEN/Akt/mTOR信號通路對不同化療藥物敏感性的影響。方法 K562/ADM細胞分為未轉染組、轉染野生型PTEN組（Ad-PTEN-GFP）、轉染空載體組（Ad-GFP），并與不同濃度雷帕霉素或三氧化二砷（As2O3）聯合作用。通過MTT法檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡率，熒光定量PCR檢測PTEN、mTOR、BCL-2及BAXmRNA水平，Western blot檢測 PTEN及 Akt、p-Akt蛋白水平。結果 野生型PTEN對K562/ADM細胞最大增殖抑制率為32.3%，與未轉染組及Ad-GFP組相比，Ad-PTEN-GFP組mTORmRNA和p-Akt蛋白明顯減低;雷帕霉素與As2O3聯合應用后細胞增殖明顯受抑，凋亡率（28.61% ±1.46%）明顯高于單藥作用組（P＜0.05），BCL-2mRNA表達降低，BAXmRNA表達增加，以聯合干預組最為明顯。結論 PTEN/Akt/mTOR信號傳導通路能夠增加K562/ADM細胞對雷帕霉素及As2O3的敏感性。

Akt;PTEN;mTOR;雷帕霉素;三氧化二砷

*通信作者（corresponding author）:dzczy@sohu.com

PI3K/Akt/mTOR通路是細胞內重要的信號傳導通路，通過激活或抑制下游多種信號分子的表達，在細胞增殖、凋亡及多藥耐藥中發揮重要的生物學功能［1］。與張力蛋白同源的10號染色體缺失的磷酸酶基因（PTEN）通過調控PI3K/Akt通路的去磷酸化發揮抑制腫瘤生長的功能。有研究表明，PTEN在包括造血系統腫瘤在內的多種腫瘤中表達降低，與腫瘤的不良預后密切相關［2－4］。

新近研究顯示，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路調控失常與白血病發病存在相關性［5－6］。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）是一種新型的大環內酯類免疫抑制劑，通過抑制mTOR發揮抗腫瘤增殖作用。三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）具有廣泛的抗腫瘤作用，特別是對白血病細胞和肝癌細胞有明確的生長抑制作用。其作用機制可能與誘導細胞分化或促凋亡有關，但其分子生物學機制尚有待進一步研究［7－8］。

K562/ADM細胞是對包括阿霉素在內的多種化療藥物耐藥的人白血病細胞系。本實驗探討野生型PTEN基因聯合RAPA和或As2O3對K562/ADM細胞的增殖抑制作用及其可能的分子機制，為進一步的體內實驗與臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及藥物:反轉錄反應體系及引物（北京賽百盛生物工程公司）、SYBR Green Real Master Mix（北京天根生化科技有限公司）;PTEN、Akt、SER 473 p-Akt鼠抗人單克隆抗體（Santa Cruz公司）、HRP標記的山羊抗鼠IgG（北京鼎國生物公司）;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（北京寶賽生物）;雷帕霉素（華北制藥有限責任公司）、三氧化二砷（As2O3）（哈爾濱伊達藥業有限公司）。

1.1.2 腺病毒及細胞系:重組腺病毒Ad-PTEN-GFP和Ad-GFP由上海吉凱生物公司合成并鑒定，在人胚腎細胞系293A細胞中進行擴增及滴度測定。293A細胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中培養，K562/ADM細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養;均在37℃含5%CO2飽和濕度環境培養。兩種細胞均為本實驗室長期保存品種。

1.2 方法

1.2.1 腺病毒轉染和轉染效率的測定:按感染復數（Multiplicity of infection，MOI）為200 在100 μL無血清培養液中加入含有PTEN基因（Ad-PTEN-GFP組;PTEN組）或空載體（Ad-GFP組;Ad組）的病毒液后轉染K562/ADM細胞，在37℃、含5%CO2、無血清、無抗生素的1640培養基中孵育2 h后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液繼續培養，48 h后流式細胞儀檢測兩組表達綠色熒光蛋白的細胞比例，計算轉染效率及對細胞增殖抑制率的影響。

1.2.2 腺病毒轉染及藥物聯合干預實驗:RAPA用DMSO溶解，RPMI 1640培養基稀釋成儲存濃度，終濃度為20和50 nmol/L;4℃避光保存，As2O3用RPMI 1640培養基稀釋，選用終濃度為2.5和5 μmol/L。

腺病毒Ad-PTEN-GFP或Ad-GFP轉染K562/ADM細胞系后，即刻加入上述濃度的RAPA或As2O3觀察0、24、48和72 h對細胞增殖、凋亡的影響。

將RAPA與As2O3聯合應用，觀察藥物對細胞增殖、凋亡的影響，并與單藥進行對比。

1.2.3 MTT實驗:在96孔板中，每孔接種對數生長期K562/ADM細胞5 000個，每組設3個復孔，同時設立無細胞的空白對照，在干預后不同時間點，加入MTT溶液，培育4 h后離心棄上清，加入DMSO振蕩數分鐘，酶標儀讀取吸光度A490值，計算細胞生長抑制率，繪制生長曲線。細胞生長抑制率=［對照組值－實驗組］/對照組×100%。

1.2.4 凋亡率檢測:1）碘化丙啶（PI）單標檢測細胞凋亡率:收集轉染不同時間的細胞，每組收集1×106個細胞，70%乙醇4℃固定過夜;加入RNA酶，37℃水浴消化15～30 min后加入PI，4℃存放15 min以上，流式細胞儀檢測凋亡率。2）AnnexinV/PI雙染檢測細胞凋亡率:收集不同干預組細胞，1×PBS洗滌2次后加入500 μL的連接緩沖液懸浮細胞，加入10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，室溫下避光、反應15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 實時熒光定量PCR:1）收集不同處理組細胞，Trizol提取總RNA，電泳鑒定RNA并定量，反轉錄合成cDNA。2）實時熒光定量PCR反應:SYBR反應體系共25 μL。反應條件為94℃ 5 min，94℃45 s，60℃ 1 min，30個循環，設空白對照。PCR反應前3～15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，調節基線至適宜處，各熒光曲線與基線交叉點的循環數即為 Ct值。根據 ΔCt=Ct（目的基因）－Ct（β-actin），ΔΔCt=2－ΔCt計算檢測基因 mRNA 相對表達量，每組重復3次取平均值。PCR引物序列（表1）。

表1 FQPCR擴增引物序列Table 1 Primer sequence of FQPCR

1.2.6 Western blot法檢測靶蛋白表達水平:收集不同組 K562/ADM細胞，每組取107個細胞，加入200 μL預冷的蛋白裂解液，4℃裂解1 h，冰浴下超聲裂解15 min。4℃ 18 000×g離心20 min，取上清用考馬斯亮藍試劑盒測定蛋白濃度，分裝后置－20℃保存。取80 μg樣品蛋白質加入等體積上樣緩沖液，經5%濃縮膠和10%SDS-PAGE凝膠電泳后，用水浴式電轉儀轉至硝酸纖維素膜上。經5%BSA 37℃封閉1 h，分別加入1∶500稀釋的小鼠抗人PTEN、Akt和 p-Akt單克隆抗體，4℃培育過夜。TBS漂洗5 min×3次，加入山羊抗小鼠HRP標記二抗，37℃孵育1 h，TBS漂洗5 min×3次。化學發光法檢測后分析結果。

1.3 統計學分析

所有數據用SAS 8.0統計軟件分析處理，計量資料進行t檢驗，F檢驗及q檢驗。

2 結果

2.1 過表達PTEN基因對K562/ADM的增殖抑制作用

當MOI為200時，流式細胞直接檢測腺病毒感染K562/ADM細胞的效率為82.2% ±5.8%，符合基因治療對載體的要求（圖1）。

轉染后第4～7天，各組K562/ADM細胞的增殖抑制出現顯著差別，Ad-PTEN-GFP組細胞的最大生長抑制率（32.3%）出現在第5天，顯著高于Ad-GFP組（P＜0.01）（圖2）。

圖1 以MOI=200轉染3 d后細胞轉染效率Fig 1 The transfection rate of K562/ADM cells after transfected with Ad-GFP or Ad-PTEN-GFP for the 3 days，with MOI=200

圖2 PTEN對K562/ADM細胞的生長抑制曲線Fig 2 Anti-proliferation effect of PTEN on K562/ADM cells

2.2 野生型PTEN增加K562/ADM細胞對RAPA與As2O3的敏感性

干預后3 d，RAPA處理組:PTEN+RAPA 20及50 nmol/L組的A值均低于Ad+RAPA 20及50 nmol/L組（P＜0.01）;As2O3處理組:PTEN+As2O32.5及5 μmol/L組A值均低于 Ad+As2O32.5 及5 μmol/L組（P＜0.01）（圖3）。

轉染 3 d后，RAPA干預組:PTEN+RAPA 20 nmol/L組的凋亡率（29.1% ±3.7%）高于Ad+RAPA 20 nmol/L組（19.8% ±2.5%）（P＜0.05）;PTEN+RAPA 50 nmol/L組的凋亡率（34.9% ±3.5%）高于Ad+RAPA 50 nmol/L組（23.1% ±2.8%）（P＜0.01）;As2O3干預組:PTEN+As2O32.5 μmol/L組的凋亡率（50.6% ± 6.2%）高于 Ad+As2O32.5 μmol/L組（36.8% ±4.1%）（P＜0.01）;PTEN+As2O35 μmol/L組的凋亡率（69.2% ±5.2%）高于Ad+As2O35 μmol/L組（41.7% ±4.6%）（P＜0.01）。

2.3 RAPA和/As2O3對K562/ADM細胞增殖抑制的影響

不同組藥物干預3 d后，RAPA 20 nmol/L+As2O32.5 μmol/L組的A值明顯低于RAPA 20 nmol/L組及As2O32.5 μmol/L組（P＜ 0.01）;RAPA 50 nmol/L+As2O35 μmol/L組的A值明顯低于RAPA 50 nmol/L組及As2O35 μmol/L組（P＜0.01）。不同濃度RAPA與不同濃度As2O3聯合作用組A值均低于各藥物單獨干預組（P＜0.05）（圖4）。

圖3 不同濃度RAPA及As2O3對轉染Ad-PTEN-GFP或Ad-GFP的K562/ADM細胞增殖抑制的影響Fig 3 The effect of different concentration rapamycin or arsenic trioxide treatment on the growth inhibition of K562/ADM cells transfected with Ad-PTEN-GFP or Ad-GFP

在RAPA及As2O3單藥或聯合應用24 h后，RAPA 20 nmol/L+As2O32.5 μmol/L 組 的 凋 亡 率（19.71% ±1.18%）明顯高于 RAPA 20 nmol/L組（9.09% ±0.38%）或 As2O32.5 μmol/L組（14.79%±0.69%），（P＜0.01）;RAPA 50 nmol/L+As2O35 μmol/L組的凋亡率（28.61% ±1.46%）明顯高于RAPA 50 nmol/L組（12.54% ±0.43%）或 As2O35 μmol/L組（20.21% ±1.29%）（P＜0.01）。

2.4 野生型PTEN、RAPA與As2O3對K562/ADM細胞中PI3K/Akt/mTOR信號傳導通路的影響

2.4.1 轉染野生型PTEN基因降低p-Akt蛋白水平及mTORmRNA水平:轉染 Ad-PTEN-GFP后，PTENmRNA（25.43±6.77）和蛋白表達水平明顯高于Ad-GFP轉染組（0.473±0.317）及未轉染對照組（0.477±0.211）（P＜0.01）（圖5）。

轉染Ad-PTEN-GFP后，p-Akt表達水平明顯下降，低于未轉染組和Ad-GFP組（P＜0.01）。

同樣，K562/ADM細胞轉染PTEN基因后，mTORmRNA表達水平（0.219±0.042）明顯低于未轉染組（0.512±0.077）和 Ad-GFP組（0.501±0.071）（P＜0.01）。

2.4.2 RAPA對Akt、p-Akt及mTOR表達的影響:RAPA對Akt及p-Akt無明顯抑制作用，但明顯抑制mTORmRNA表達，未干預組、20 nmol/L和50 nmol/L RAPA組mTORmRNA表達水平分別為:0.512±0.077;0.248±0.067;0.152±0.054（P＜0.01），呈劑量依賴性減低。

2.4.3 As2O3對 Akt、p-Akt及 mTOR表達的影響:Akt無明顯變化，p-Akt表達水平降低（圖5），各組間P＜0.01，表明As2O3可以呈劑量依賴性抑制p-Akt表達。As2O3作用后mTOR有輕度減低，但無明顯抑制作用。

2.5 野生型 PTEN基因、RAPA與 As2O3對K562/ADM細胞凋亡分子的影響

轉染Ad-PTEN-GFP組BCL-2表達水平低于轉染Ad-GFP組（P＜0.05），BAX表達水平則高于Ad-GFP組（P＜0.05）。Ad-PTEN-GFP與 RAPA或As2O3聯合作用組BCL-2表達低于Ad-GFP聯合RAPA或As2O3作用組（P＜0.05），BAX表達水平與BCL-2表達水平相反。

RAPA與As2O3聯合作用組BCL-2mRNA表達水平低于單獨作用組，BAXmRNA表達水平則高于單獨作用組（P＜0.05）（表2）。

表2 PTEN基因、RAPA、As2O3及聯合作用組于K562/ADM 細胞3 d后BCL-2、BAX mRNA表達水平的影響Table 2 The BCL-2，BAX mRNA expression levels in K562/ADM cells transfected with Ad-PTENGFP or Ad-GFP together with rapamycin or arsenic trioxide，or treated with rapamycin and/or arsenic trioxide for 3 days

3 討論

PI3K/Akt通路是細胞內重要的信號傳導通路，通過激活下游 mTOR、NF-κB，進一步促進 BCL-2、BCL-xL表達，抑制P53、滅活caspase、誘導細胞周期基因轉錄或其轉錄調控子的生成等，在促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、誘導腫瘤細胞多藥耐藥等方面發揮重要作用［1］，包括白血病在內的多種腫瘤中存在此信號通路的功能異常。

研究顯示PI3K抑制劑可以抑制白血病細胞增殖，同時增加其對依托泊苷、阿糖胞苷和As2O3等傳統化療藥物的敏感性［8－9］。

PTEN通過其磷酸酶活性調控PI3K/Akt通路去磷酸化，發揮腫瘤抑制功能［1－3］，研究發現，PTEN基因在白血病中突變罕見，但有不同程度缺失、低表達及甲基化。將野生型PTEN轉染急性髓系白血病（AML）耐藥細胞系HL60AR和急性淋巴細胞白血病（ALL）細胞系 EU-1后，分別增加了細胞對As2O3［8］及阿霉素［10］的敏感性。PTEN 去甲基化后可逆轉Ph+ALL細胞對伊馬替尼的耐藥［11］。

本研究結論與上述研究一致，通過將野生型PTEN轉染K552/ADM細胞后，可以增加該細胞對RAPA或As2O3的敏感性。RAPA為mTOR抑制劑，PTEN基因可以直接或間接抑制mTOR表達，RAPA與野生型 PTEN聯合作用后，可抑制 PI3K/Akt/mTOR通路，發揮協同抗腫瘤作用。As2O3自身具有抑制p-Akt的活性，與PTEN基因轉染聯合作用于K562/ADM細胞后，通過抑制p-Akt活性，增加了細胞對As2O3的敏感性。

根據本研究結果推測，RAPA抑制mTOR表達、As2O3抑制p-Akt表達，兩藥合用增強了對PI3K/Akt/mTOR通路抑制作用，從而發揮協同抗腫瘤效果。

本研究還發現轉染PTEN基因或RAPA與As2O3單藥處理K562/ADM細胞后均可以單獨抑制BCL-2，增加BAXmRNA的表達，在聯合作用后，抑制BCL-2及增加BAXmRNA表達的作用明顯增強，從而提示上述方法聯合應用后可以增加相互之間的協同作用。

本研究通過將野生性PTEN基因轉染K562/ADM細胞，證實了野生型PTEN基因可以增加K562/ADM細胞對RAPA或As2O3藥物的敏感性，同時RAPA與As2O3聯合應用增強了對K562/ADM細胞的增殖抑制作用，通過探討上述協同作用的可能的分子機制，為逆轉白血病多藥耐藥提供理論依據。

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PTEN/Akt/mTOR pathway enhances drug sensitivity in K562/ADM cells

CHENG Zhi-yong1*，WANG Su-yun2，BIAN Yong-sheng1，WEN Xing-chu1，YANG Ning1，GAO Xiao-li1，HAN Ying1，PAN Ling3

（1.Dept.Hematology and Oncology，the First Hospital of Baoding，Baoding 071000;2.Dept.Hematology，Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050000;3.West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

ObjectiveTo investigate the influence of PTEN/Akt/mTOR pathway in drug sensitivity of K562/ADM cells.MethodsK562/ADM cells were divided into untrsfected group，transfected with PTEN group（Ad-PTENGFP），transfected with empty vector group（Ad-GFP）.Each group was treated with rapamycin and or arsenic trioxide at different concentrations.The inhibited rate of K562/ADM cells from each group was measured by MTT assay;the apoptosis rate was assessed by flow cytometry（FCM）.The mRNA expression ofPTEN，mTOR，BCL-2andBAXwere detected by real-time fluorescent relative-quantification reverse transcriptional PCR（FQ-PCR）.PTEN，Akt and p-Akt protein levels were detected by western blotting.ResultsThe maximum growth inhibition rate was 32.3%after transfected withPTENgene.Compared with Ad-GFP group，after transfacted with Ad-PTENGFP into K562/ADM cells，p-Akt protein andmTORmRNA expression levels were down-regulated.RAPAmycin and arsenic trioxide had synergistic effect on growth inhibition of K562/ADM cells and the inhibition rate（28.61±1.46%）was higher than that in cells with single drug treatment（P＜0.05）.BCL-2mRNA was down-regulated butBAXmRNA up-regulated，especially in combination groups.ConclusionsPTEN/Akt/mTOR pathway can enhance the anti-leukemia effect of rapamycin and arsenic trioxide in K562/ADM cells.

Akt;PTEN;mTOR;RAPAmycin;arsenic-trioxide

R 733

A

1001-6325（2012）01-0049-07

2010－12－29

2011－06－15

保定市科技攻關計劃（11ZF003）