抗TNF-α抗體治療大鼠肝肺綜合征

馮英梅，劉 麗，劉 楠，趙 芝

（1.河北醫科大學第二醫院消化內科河北省消化病重點實驗室河北省消化病研究所，河北石家莊 050000;2.辛集市第一醫院，河北辛集 052360）

抗TNF-α抗體治療大鼠肝肺綜合征

馮英梅1，2，劉 麗1*，劉 楠1，趙 芝1

（1.河北醫科大學第二醫院消化內科河北省消化病重點實驗室河北省消化病研究所，河北石家莊 050000;2.辛集市第一醫院，河北辛集 052360）

目的 探討抗TNF-α單克隆抗體（TNF-αMcAb）對肝肺綜合征（HPS）大鼠NF-κB表達的影響及NF-κB在抗TNF-α單克隆抗體治療大鼠肝肺綜合征中的作用。方法 用膽總管結扎術（CBDL）建立大鼠HPS模型，經腹腔注射抗TNF-αMcAb（0.1 mg/kg·2 d）治療HPS，HE染色觀察肺組織病理變化;放射免疫法檢測血漿TNF-α的水平;鱟試劑盒檢測血漿內毒素水平;進行血氣分析，計算肺泡-動脈氧分壓梯度差的變化;Western blot方法進行肺組織NF-κB蛋白表達定量分析。結果 抗TNF-αMcAb干預后肺組織的炎性反應和毛細血管擴張明顯減輕;肺泡-動脈氧分壓梯度差明顯減少（P＜0.05）;血漿內毒素和TNF-α的水平較膽總管結扎組明顯減低（P＜0.05）;肺組織NF-κB蛋白表達水平顯著下降（治療前:0.93±0.23;治療后:0.75±0.18）（P＜0.05）。結論 抗TNF-α單克隆抗體可能通過抑制NF-κB的表達治療肝肺綜合征。

腫瘤壞死因子-α;腫瘤壞死因子-α單克隆抗體;肝肺綜合征;核轉錄因子-κB

*通信作者（corresponding author）:loraliu@yeah.net

肝肺綜合征（hepatopulmonary syndrome，HPS）是各種慢性肝病的嚴重并發癥之一，是在慢性肝病和（或）門靜脈高壓基礎上出現的肺血管擴張和動脈血氧合功能異常［1］。目前認為HPS的發病機制與細菌異位和腸源性內毒素血癥（intestinal endotoxemia，IETM）有關，IETM 時 TNF-α 表達上調，細菌內毒素及TNF-α可激活巨噬細胞核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），誘導轉錄并促進多種細胞因子合成，從而導致HPS發生［2］。本研究旨在探討抗TNF-α單克隆抗體對HPS的治療作用以及是否通過抑制NF-κB的表達治療HPS。

1 材料與方法

1.1 材料

抗大鼠TNF-αMcAb（第四軍醫大學免疫教研室），鱟試劑盒（北京安度斯生物技術公司），檢測TNF-α的放免試劑盒（北京普爾偉業生物科技公司），抗NF-κB多克隆抗體（北京中山生物技術公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠HPS模型的建立及實驗分組:采用膽總管結扎術（CBDL）建立大鼠HPS模型［1］。按照中華人民共和國技術監督局GB14922-94《實驗動物微生物和寄生蟲檢測等級》的標準，選用清潔級成年健康雄性SD大鼠60只，體質量（250±25）g，合格證編號:807145，由河北醫科大學實驗動物中心提供。隨機分為假手術組、膽總管結扎組和干預組。膽總管結扎組:于結扎后1、2、3、4及5周麻醉動物（每個時間點6只大鼠）;干預組:于結扎后第2周，開始腹腔內注射抗TNF-αMcAb（0.1 mg/kg·2 d），并于干預后1、2、3及4周麻醉動物（每個時間點6只大鼠）;假手術組（6只大鼠）:僅分離膽總管不結扎，與CBDL 5周的模型組動物同批麻醉，留取各組動物的肺組織及動、靜脈血樣。

1.2.2 肺組織病理檢查:取肺組織塊約5×5×5 mm大小，以10%的甲醛固定后，依次進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規石蠟切片、蘇木素-伊紅染色，在光鏡下觀察肺組織的病理學變化。

1.2.3 動脈血氣分析:用抗凝劑處理的無菌注射器抽取腹主動脈血1 mL，以橡膠塞封口后，立即送檢進行血氣分析，結果以P（A-a）O2（肺泡-動脈氧分壓梯度差）表示。

1.2.4 血清TNF-α、內毒素的測定:取血清樣本分別進行下列檢測:1）TNF-α的測定:按照大鼠放射免疫試劑盒說明書，檢測TNF-α的水平。2）內毒素的測定:按照鱟試劑盒說明書操作，實驗中用的材料均無熱原。

1.2.5 Western blot方法檢測肺組織NF-κB蛋白表達:取100 mg肺組織，用冰冷的PBS漂洗2次，置于勻漿器中，然后加入1 mL改良的RIPA（radioimmune precipitation assay，RIPA）裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，2 mg/L leupeptin），充分研磨以充分裂解組織，冰上靜置30 min，低溫高速10 000×g離心15 min，收集上清，考馬斯亮藍比色法測定蛋白含量。取150 μg蛋白，進行10%SDS-PAGE分離，轉膜，分別用兔抗NF-κB單克隆抗體（1∶200稀釋）、兔抗 GAPDH 抗體（1∶250稀釋），二抗（1∶2 000稀釋）與硝酸纖維素膜雜交。然后將膜置于魯米那ECL中1 min，曝光，顯影，定影。采用 BandScan圖像分析軟件對Western blot結果進行定量分析，灰度值以積分吸光度值（Integral Absorbance，IA）表示，結果以目的蛋白與GAPDH的IA的比值表示。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 肺組織病理變化

HE染色顯示，假手術組:肺泡呈半球形的小囊，壁薄，相鄰肺泡之間可見由薄層結締組織構成的肺泡隔。膽總管結扎組:大鼠肺臟肺泡隔增寬，肺間質內炎性反應明顯，可見巨噬細胞，肺間質毛細血管密度有所增加，提示肺間質血管擴張、充血，部分區域的肺泡腔變小。干預組:肺臟毛細血管輕度擴張，肺泡間隔輕度增寬（圖1）。

2.2 動脈血氣分析檢測

CBDL術后 2周，肺泡-動脈氧分壓梯度差［P（A-a）O2］即明顯升高，高于假手術組（P＜0.05），抗 TNF-α單克隆抗體干預治療后1周與CBDL術后同周組比較，肺泡-動脈氧分壓梯度差［P（A-a）O2］有所下降，之后呈下降趨勢，至干預治療后3周與同周CBDL組比較有明顯差異（P＜0.05）。但仍高于同周sham組（P＜0.05）（表1）。

2.3 血漿內毒素檢測

CBDL術后1周，血漿內毒素水平明顯升高（P＜0.05），抗TNF-α單克隆抗體干預治療后1周，血漿內毒素水平開始明顯下降，且與同周CBDL組比較明顯降低（P＜0.05）。之后逐漸下降，但仍高于同周sham組（P＜0.05）（表2）。

圖1 肺組織病理變化Fig 1 Histopathological changes in lung（HE×200）

表1 CBDL術后不同時間各組P（A-a）O2水平Table 1 The level of P（A-a）O2at various time points（mmHg，x±s，n=6）

表2 CBDL術后不同時間各組血清內毒素水平Table 2 The level of plasma ETX at various time points（EU/L，x ± s，n=6）

表3 CBDL術后不同時間各組血漿TNF-α水平Table 3 The level of plasma TNF-α at various time points（ng/mL，x ± s，n=6）

2.4 血漿TNF-α檢測

CBDL術后1周，血漿 TNF-α水平即升高，至CBDL術后3周時達峰值;抗TNF-α單克隆抗體干預治療后1周即開始明顯降低，且與同周CBDL組比較有明顯差異（P＜0.05）。之后繼續下降，至干預治療后4周仍高于同周sham組（P＜0.05）（表3）。

2.5 肺組織NF-κB蛋白表達檢測

CBDL后，隨著結扎時間延長肺組織NF-κB蛋白表達逐漸增加，術后2周（0.76±0.24）即顯著高于sham組（0.43±0.16），至結扎第3周（0.93±0.23）達高峰，后逐漸下降，但仍比sham組表達水平高（P＜0.05）。抗TNF-α單克隆抗體干預治療后2周（0.67±0.15）開始明顯下降，至干預第2周（0.75±0.18）與同周 CBDL組（0.93±0.23）比較（P＜0.05）。之后在此水平波動，仍高于sham組（P＜0.05）（圖2）。

3 討論

HPS是慢性肝病的嚴重并發癥［3］，目前研究認為在 HPS形成過程中，伴隨著 IETM 的產生［4］，TNF-α是IETM的主要介導因子，內毒素血癥通過上調TNF-α從而誘導單核/巨噬細胞及其核轉錄因子NF-κB激活，肺血管內巨噬細胞的集聚和浸潤，導致瀑布樣級聯反應，大量細胞因子的釋放［5］，從而導致肺血管的擴張，導致HPS發病率及嚴重程度增加［6－7］。

NF-κB是細胞中一個重要的轉錄因子，活化后可特異地結合κB位點，從而激活相關基因的轉錄表達［8］。離體研究表明，諸多炎性介質編碼基因的增強子或啟動子上多存在κB位點，并受NF-κB的轉錄調控。目前比較明確的受NF-κB調控的靶基因包括細胞因子、急性期反應蛋白、黏附分子、巨噬細胞集落刺激因子及單核細胞趨化蛋白MCP1/JE等［9－10］。

圖2 肺組織NF-κB蛋白表達Fig 2 The expression of p65 NF-κB（65 ku）protein of lung tissue by Western blot（x ± s，n=6）

本研究結果發現大鼠CBDL術后血漿內毒素水平、TNF-α水平顯著升高，大鼠肺組織 NF-κB蛋白表達隨著TNF-α的升高而升高，肺泡-動脈氧分壓梯度差P（A-a）O2也顯著升高，肺病理變化明顯，提示TNF-α是HPS形成過程中重要介導因子。

TNF-α的生物學活性是通過與 TNF-α受體（TNF-R）結合而發揮的［11］。抗 TNF-αMcAb 能中和循環中的TNF-α，阻斷TNF-α的作用。

本研究成功地建立了HPS模型。在CBDL術后1周，開始用抗TNF-αMcAb干預治療。結果表明，早期應用抗TNF-αMcAb干預治療，改善了肺組織的炎性反應，肺泡-動脈氧分壓梯度差P（A-a）O2有明顯下降，此過程中血漿TNF-α水平及肺組織NF-κB蛋白表達均下降，從而為抗TNF-αMcAb應用于臨床治療HPS提供依據。

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The treatment of hepatopulmonary syndrome using anti-tumor necrosis factor-α monoclonal antibody in rats

FENG Ying-mei1，2，LIU Li1，LIU Nan1，ZHAO Zhi1

（1.Dept.of Gastroenterology，the Second Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000;2.the First Hospital of Xinji，Xinji 052360，China）

ObjectiveTo study the effects of anti-tumor necrosis factor-α monoclonal antibody on the expression of NF-κB on hepatopulmonary syndrome in rats and the effects of NF-κB in treating hepatopulmonary syndrome in rats with anti-tumor necrosis factor-α monoclonal antibody.MethodsThe experimental models of HPS in rats were developed with commom bile duct ligation，and then were injected with anti-TNF-αMcAb（0.1 mg/kg·2 d）intraperitoneally，Lung histopathological changes were evaluated by hematoxylin and eosin staining;TNF-α concentration in plasma was measured by radioimmunity method;The endotoxin in the plasma was checked by tachypleus amebocyte lysate kit;Hepatopulmonary syndrome was assessed by measurements of alveoloarterial oxygen difference（P（A-a）O2）.Western blot was employed to investigate the expression and the changes of NF-κB in hepatopulmonary rat lungs.ResultsCompared with the CBDL group，there was a gentle vasodilatation and widen interalveolar septum in lung in anti-TNF-αMcAb treament group，the level of the P（A-a）O2was significantly lower（P＜0.05）.The concentration of ETX and TNF-α were significantly lower（P＜0.05）.The expression of NF-κB in CBDL+anti-TNF-α McAb group（0.75±0.18）decreased obviously than those in CBDL group（0.93±0.23）（P＜0.05）.ConclusionsAnti-tumor necrosis factor-α antibody can reduce the expression of NF-κB and attenuate the severity of hepatopulmonary syndrome through downregulateing the expressiion of NF-κB.

TNF-α;anti-TNF-αMcAb;hepatopulmonary syndrome;NF-κB

R 575.2

A

1001-6325（2012）01-0061-05

2010－12－27

2011－06－09

河北省醫學科學研究重點課題（08080）