TGFβ1，CTGF信號傳導通路在小鼠肝纖維發生中的作用

胡云龍，孔 麗

（1.河北醫科大學第三醫院醫教科;2.中西醫結合肝病科，河北石家莊 060051）

TGFβ1，CTGF信號傳導通路在小鼠肝纖維發生中的作用

胡云龍1*，孔 麗2

（1.河北醫科大學第三醫院醫教科;2.中西醫結合肝病科，河北石家莊 060051）

目的 探討實驗性肝纖維化小鼠肝組織中TGFβ1，CTGF信號傳導通路的變化及意義。方法 將小鼠隨機分為對照組、肝纖維化模型組（腹腔注射10%的CCl4橄欖油），8周后應用酶法和放射免疫法檢測血清ALT、HA水平，HE染色、Masson染色觀察肝組織炎性反應及纖維化程度，免疫組化法和RT-PCR法檢測肝組織α-SMA、TGFβ1、TGFβRⅡ、Smad3、Smad7、CTGF蛋白和mRNA水平。結果 模型組血清ALT及HA水平明顯高于對照組;肝組織 α-SMA、TGFβ1、TGFβRII、Smad3 及 CTGF（8.21 ± 1.48、5.52 ±0.89、0.52 ±0.04、5.86 ±1.49、5.49 ±0.29）蛋白表達明顯高于對照組（1.51±0.95、1.31±0.81、0.37±0.04、1.41±0.95、0.31±0.19）（P＜0.01）;而模型組肝組織Smad7（1.83±0.62）蛋白和mRNA表達較對照組（6.32±1.18）顯著降低（P＜0.01）。各指標mRNA表達與蛋白表達一致。結論 TGFβ1和CTGF信號傳導通路過度活化，Smad7表達和負調節TGFβ、CTGF信號傳導通路的功能被抑制可能與肝纖維化的發生和發展密切相關。

肝纖維化;轉化生長因子β1;Smad蛋白;結締組織生長因子;信號傳導通路

肝纖維化是指各種致病因素持續或反復損傷肝臟所導致的肝臟內結締組織增生，細胞外基質（extracellular matrixc，ECM）合成大于降解，導致ECM過度沉積的病理過程。研究發現，肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）激活及表型轉化是肝纖維化形成的中心環節［1］，轉化生長因子β1（transforming growth factor-β，TGFβ1）是激活HSC的主要細胞因子［2］，Smad蛋白是其下游信號傳導因子，在肝纖維化中發揮重要作用。結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是近年發現的與肝纖維化形成相關的細胞因子，可能為TGFβ1信號下游高效反應元件，可特異性介導TGFβ1刺激成纖維細胞增生，促進組織器官纖維化形成等生物學作用，但其在肝纖維化發生中的確切機制尚不清楚，因此本研究觀察肝組織中TGFβ1、CTGF信號傳導通路中相關信號分子蛋白和mRNA表達，闡明其在肝纖維化發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 肝纖維化小鼠模型的建立

SPF級8周齡雌性C57BL/6J小鼠30只，體質量18～22 g（河北醫科大學實驗動物中心，合格證號1008169），隨機均分為對照組（control group）給予腹腔注射0.9%氯化鈉注射液和肝纖維化模型組（model group）給予腹腔注射10%的CCl4橄欖油，每周2次，共8周，8周后留取血清及肝組織標本。部分肝組織用10%中性甲醛固定，其余肝組織用液氮快速冷凍、－80℃冰箱保存備提取RNA。

1.2 藥品及試劑

CCl4（天津市北宏試劑廠），TGFβ1、TGFβRII、Smad3、Smad7和CTGF等（北京中杉生物技術有限公司）。RT-PCR試劑盒及相關試劑（北京賽百盛公司）。

1.3 方法

1.3.1 血清ALT和HA檢測:采用Olympas7100全自動生化儀酶法和放射免疫法檢測。

1.3.2 肝組織病理學分析:常規制片，HE和Masson染色，炎性反應分級及纖維化分期參見2000年中華醫學會傳染病和寄生蟲病分會修訂的《病毒性肝炎防治方案》［1］

1.3.4 肝組織免疫組化檢測:用 SP法，α-SMA、TGFβ1、TGFβRII、Smad3、Smad7 和 CTGF 等一抗工作液濃度分別為1∶200、1∶150、1∶100、1∶100、1∶50和1∶50，PBS 代替一抗作陰性對照，TGFβ1、Smad3、Smad7和CTGF蛋白在肝組織中的陽性表達為相應的細胞質內呈現棕褐色顆粒，TGFβRII蛋白在肝組織中的陽性表達為相應的細胞膜呈現棕褐色顆粒。應用Olympus BX51光學顯微鏡攝片（物鏡×20）。采用北京航空航天大學真色彩病理圖像分析系統分析結果，每個樣本取3張切片，每張切片取5個視野進行圖像分析，分析各圖象陽性面密度（陽性細胞所占面積/視野總面積×100%）進行半定量分析。

1.3.5 肝組織 TGFβ1、Smad3、Smad7、CTGFmRNA表達檢測:用RT-PCR法，采用Trizol試劑一步法提取肝組織總RNA，合成cDNA，PCR擴增。PCR引物設計、反應條件等如表1所示。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀觀察，應用法國VL公司BIO-PROFIF凝膠圖象分析系統Bio-1D++分析軟件對目的電泳條帶進行分析，以目的基因條帶與內參照GAPDH條帶吸光度值之比表示表達量。

1.4 統計學分析

表1 TGFβ1、Smad3、Smad7、CTGF 和 GAPDH 引物序列Table 1 Primer of TGFβ1，Smad3，Smad7，CTGF and GAPDH

2 結果

2.1 小鼠血清ALT、HA水平

模型組血清ALT（169±14 U/L）、HA（1610±126 μg/L）分別高于對照組的47.90±8.10 U/L和759 ±77 μg/L（P＜0.01）。

2.2 小鼠肝組織病理觀察

對照組小鼠肝小葉結構正常，無肝細胞壞死及纖維組織增生;模型組小鼠肝組織小葉內可見點狀或灶狀肝細胞壞死伴炎性細胞浸潤，匯管區及竇周可見大量纖維組織增生，形成纖維間隔分割肝小葉。

2.3 小鼠肝組織α-SMA蛋白表達

對照組小鼠肝組織內無α-SMA陽性染色。模型組小鼠肝組織中α-SMA表達明顯升高，可見于匯管區血管壁、肝纖維組織與肝實質交界處，竇周間隙，中央靜脈壁中。模型組肝組織α-SMA陽性面密度值為8.21±1.48明顯高于對照組的1.51±0.95（P＜0.01）。

2.4 小鼠肝組織TGFβ1、TGFβRII、Smad3、Smad7和CTGF蛋白表達

對照組小鼠TGFβ1少量表達于肝組織，模型組TGFβ1陽性表達明顯增多，可見于匯管區周圍細胞、中央靜脈血管壁、增生的纖維間隔、竇周細胞等;TGFβRII在對照組小鼠肝組織少量表達于肝細胞及HSC細胞膜上，模型組TGFβRII在上述部位的表達顯著增加;對照組小鼠肝組織Smad3少量表達于匯管區基質及間質細胞質，Disse間隙等，而模型組肝組織中匯管區、纖維間隔間質細胞、炎性反應細胞、成纖維細胞、竇周細胞等胞質大量表達;Smad7大量分布于對照組小鼠肝細胞胞質及部分肝細胞核膜，模型組肝組織Smad7陽性細胞數顯著減少，見于少部分肝細胞及纖維間隔梭狀細胞;CTGF在對照組基本無陽性表達，模型組CTGF蛋白表達呈黃色或棕黃色，主要分布在匯管區、門靜脈及纖維間隔、肝星狀細胞等位置。模型組肝組織 TGFβ1、TGFβRII、Smad3 和 CTGF 陽性面密度值明顯高于對照組（P＜0.01），模型組Smad7陽性面密度值低于對照組（P＜0.01）（圖1，表2）。

圖1 TGFβ1、TGFβRII、Smad3、Smad7、CTGF 和 α-SMA 在小鼠肝組織中的表達Fig 1 The expression of TGFβ1，TGFβRII，Smad3，Smad7，CTGF and α-SMA in Liver tissue of mice（Immunohistochemical staining，×200）

表2 TGFβ1、TGFβRII、Smad3、Smad7、CTGF 蛋白和 mRNA 在肝組織中的表達Table 2 Expression of TGFβ1，TGFβRII，Smad3，Smad7，CTGF protein and mRNA in Liver tissue（n=15）

2.5 小鼠肝組織 TGFβ1、Smad3、Smad7和 CTGF mRNA表達

模型組肝組織TGFβ1、Smad3和CTGFmRNA表達明顯高于對照組（P＜0.01）;而Smad7mRNA表達模型組明顯少于對照組（P＜0.01）（圖2，表2）。

圖2 TGFβ1、Smad3、Smad7、CTGF，GAPDH mRNA在小鼠肝組織中的表達Fig 2 The expression of TGFβ1，Smad3，Smad7，CTGF，GAPDH mRNA in liver tissue of mice M.marker;1.control group;2.model group

3 討論

TGFβ1是激活HSC的主要細胞因子之一，是最強的肝纖維化促進劑［2］，本研究顯示，正常小鼠肝組織TGFβ1只有少量表達，肝纖維化TGFβ1蛋白和mRNA表達明顯增加，提示TGFβ1的高表達促進了肝纖維化的發生和發展。TGFβRII正常分布于肝細胞及HSC的胞膜上，當發生肝纖維化時TGFβRII蛋白表達明顯上調，說明肝纖維化時TGFβ1/Smads通路的上游信號分子存在過度活化。

Smad蛋白是TGFβ1跨細胞膜傳入HSC細胞核的關鍵蛋白，TGFβ1與細胞膜上的 TGFβRII結合后，活化 TGFβRI，使 Smad2或 Smad3 C末端磷酸化，并與Smad4形成異聚體轉錄復合物，移位至細胞核與序列特異的DNA結合，誘導基因轉錄，介導HSC向MFB轉化，使纖維化產生和不斷發展［3－4］。Smad7基因是TGFβ1信號傳導通路的抑制元件，通過與活化的TGFβI型受體結合，一方面抑制Smad2、Smad3的磷酸化，另方面抑制Smad2、Smad3與受體結合，在TGFβ信號傳導中構成負反饋環路，發揮抗纖維化作用［5－6］。本研究顯示，Smad7蛋白大量分布于正常小鼠肝細胞胞質及部分核膜，在纖維化小鼠肝組織中Smad7表達減少，僅見于少部分肝細胞及纖維間隔梭狀細胞。而Smad3蛋白在正常小鼠肝組織內僅在匯管區基質及間質細胞質，Disse間隙、血管壁有少量表達;在纖維化小鼠肝組織中Smad3蛋白大量表達于匯管區、纖維間隔間質細胞、炎性細胞、成纖維細胞、竇周細胞等胞漿。Smad7和Smad3mRNA表達亦呈相同結果。

CTGF是一種由349個氨基酸組成、相對分子量為34～38 ku的富含半胱氨酸的分泌肽［7］，通過激活Ras/Raf/ERK等信號通路促進成纖維細胞增殖、活化，刺激Ⅰ、Ⅲ型膠原合成，參與ECM產生和積聚，促進纖維化疾病的發生和發展［8］。用反義技術抑制CTGF表達能明顯降低TGFβ1誘導的ECM合成，提示CTGF在TGFβ1導致的肝纖維化中起關鍵作用。本研究顯示，肝纖維化模型組小鼠肝組織CTGF蛋白和mRNA表達較對照組明顯增強，并且與TGFβ1的趨勢一致，提示CTGF在肝纖維化發生中起著重要的作用。

本研究顯示，肝纖維化時肝組織TGFβ1、CTGF、TGFβRII、Smad3表達明顯增強，Smad7表達顯著減低，TGFβ1、CTGF信號傳導通路功能明顯增強，對肝纖維化發生、發展起到了正反饋效果。尋找有效藥物抑制TGFβ1、CTGF信號通路的表達，提高Smad7的表達可能成為防治肝纖維化的一個新方向。

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Role of TGFβ1 and CTGF signaling pathway in experimental hepatic fibrosis

HU Yun-long1，KONG li2
（1.Dept.of Teaching Affairs;2.Dept.of Hepatology，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China）

ObjectiveTo investigate the mechanism of TGFβ1 and CTGF signaling pathway in experimental hepatic fibrosis mice.MethodsThirty C57BL6/J mice were divided into control group and test group（each group，n=15）.Mice were injected with CCl4which induced liver fibrosis.Serum ALT and HA were tested by enzymic method and radio-immunity.Liver inflammation was graded by HE staining，and liver fibrosis by Masson staining.The expression of proteins of TGFβ1，CTGF，TGFβRII，Smad3，Smad7 of liver tissue were examined by immunohistochemistry.The expression of TGF-β1，Smad3，Smad7 and CTGF mRNA were analyzed by RT-PCR.ResultsCompared with control group，the expression of TGFβ1，CTGF，TGFβRII，Smad3 proteins and TGFβ1，CTGF，Smad3 mRNA were increased but Smad7 protein and Smad7 mRNA were decreased in test group.The level of ALT and HA was higher in model group than that of the control group.ConclusionsTGFβ1 and CTGF pathway overactivitied may be associated with liver fibrosis.Down-regulating TGFβ，CTGF pathway and up-regulating smad7 expression may be suppressing the hepatic fibrosis.

Hepatic fibrosis;TGFβ1;Smad protein;CTGF;signalling pathway

R 575.2

A

1001-6325（2012）01-0066-05

2010－12－16

2011－06－24*< class="emphasis_bold">通信作者（corresponding author）:

（corresponding author）:ydsyhyl@163.com