用組織貼壁法從整根臍帶分離培養間充質干細胞及其生物學特性的檢測

張 顥，張 斌，程 梅，陶艷玲，扈江偉，徐 曼，陳 虎*

（1.哈爾濱市第一醫院哈爾濱血液病腫瘤研究所，黑龍江哈爾濱 150010;2.軍事醫學科學院附屬醫院造血干細胞移植科，北京 100071）

用組織貼壁法從整根臍帶分離培養間充質干細胞及其生物學特性的檢測

張 顥1，2，張 斌2#，程 梅1，陶艷玲1，扈江偉2，徐 曼2，陳 虎2*

（1.哈爾濱市第一醫院哈爾濱血液病腫瘤研究所，黑龍江哈爾濱 150010;2.軍事醫學科學院附屬醫院造血干細胞移植科，北京 100071）

目的 建立從整根臍帶分離培養間充質干細胞（UC-MSCs）的技術，并對其生物學特性進行檢測。方法 用組織貼壁法分離UC-MSCs，并通過傳代進行純化和擴增培養，繪制生長曲線，用流式細胞儀檢測UC-MSCs表面抗原及細胞周期;在特定誘導體系中，檢測UC-MSCs向脂肪、成骨及軟骨分化的潛能;用RT-PCR檢測多能干細胞標志多能干細胞標志Oct-4，Sox-2，NanogmRNA水平。結果 成功建立了UC-MSCs分離培養的方法;貼壁細胞均表達CD73、CD90及 CD105，不表達造血細胞表型CD34、CD45和HLA-DR;細胞倍增時間為（24.04±0.49）h，G0～G1期和S+G2+M期所占比例分別為81.56%和18.44%;UC-MSCs能夠向脂肪、成骨和軟骨分化;表達Oct-4，Sox-2，Nanog基因。結論 組織貼壁法是一種較好的分離培養UC-MSCs的方法，培養的細胞為更原始的間充質干細胞，增殖能力強。

臍帶;間充質干細胞;分化

*通信作者（corresponding author）:chenhu217@yahoo.com.cn

#共同第1作者

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類成體干細胞，主要來源于骨髓，具有重要的應用價值，如治療移植物抗宿主病等［1］。臍帶來源廣泛，病毒感染機會小，無倫理問題，對供者無不良影響，克服了骨髓源MSCs隨年齡增長而分化能力下降等特點，使人臍帶MSCs可能替代骨髓源MSCs，成為MSCs的主要來源之一［2］。許多學者從臍帶中分離出MSCs，一般采用酶蛋白消化法，存在著操作繁瑣、污染機率增加、細胞損傷較大及成本高等缺點［3－4］，因此尋找更為簡潔的分離培養的方法成為必要。本研究采用組織貼壁法從整根臍帶中分離MSCs，并對其進行生物學特性研究，以探討臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）更為理想的分離培養方法，為MSCs庫的建立及臨床應用奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臍帶來源于哈爾濱市第一醫院產科，經產婦同意后（簽定知情同意書），無菌條件下剖宮產的足月健康新生兒取得。Ⅱ型膠原酶、DMEM/F12培養基和胎牛血清（Gibco公司）;地塞米松、吲哚美辛、胰島素、β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸（Sigma公司）。PE標記的CD105、CD73和FITC標記的CD34、CD45、CD90和HLA-DR抗體及其相應同型對照（Becton Dickinson公司）。

1.2 UC-MSCs分離培養

取上述臍帶組織，PBS反復沖洗去除血跡，將臍帶組織剪碎至1 mm3大小，置于培養皿中，于培養皿壁加入含10%胎牛血清、100 ku/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DF-12完全培養液，置37℃、5%CO2，飽和濕度培養箱培養，每3天添加1次完全培養液，10 d后棄去臍帶組織和培養上清后全量換液，每3～4天全量換液，觀察細胞至80%匯合時，0.25%胰蛋白酶1 mmol/L EDTA 消化，按1∶3傳代。

1.3 UC-MSCs免疫表型的鑒定

取第3代處于對數生長期 UC-MSCs，按每管1×105個細胞，依次加入10 μL鼠抗人單克隆抗體PE標記的CD105、CD73，和FITC 標記的CD34、CD45、CD90和HLA-DR抗體及其相應同型對照標記細胞，室溫避光30 min;用PBS洗2～3次，流式細胞儀檢測。

1.4 生長曲線繪制

將貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，按2 ×104個/孔接種在24孔板內，每隔24 h消化3個孔，收集細胞，并用0.4%的臺盼藍計數活細胞，繪制生長曲線。

1.5 細胞周期檢測

在細胞生長的對數期，消化細胞，4℃冷70%乙醇固定并透膜24 h，10 mg/L的RNase A 37℃孵育30 min，加入50 mg/L碘化丙啶4℃避光孵育5 min，流式細胞儀檢測，ModiFIT軟件分析結果。

1.6 向脂肪細胞誘導分化

細胞以2×104/孔的密度接種于6孔板，誘導分化體系為含10%胎牛血清、10－6mol/L地塞米松、100 mg/L 1-甲 基-3-異 丁 基-黃 嘌 呤 （IBMX）、50 mg/L抗壞血酸的IMDM培養基。每3天半量換液1次。倒置顯微鏡下觀察脂肪滴的形成，第14天采用油紅O染色檢測脂肪滴。

1.7 向成骨細胞誘導分化

細胞以2×104/孔的密度接種于6孔板，誘導分化體系為含1×10－8mol/L地塞米松，2×10－4mol/L抗壞血酸，7 ×10－3mol/L β-磷酸甘油的 IMDM 培養基，每3天半量換液1次。第14天用Von Kossa染色檢測鈣化基質沉淀。

1.8 向軟骨細胞誘導分化

收集第3代細胞，取2×105個細胞放于10 mL塑料管內，1 500 r/min，離心10 min，棄上清液，加入0.5 mL軟骨誘導培養液，軟骨誘導分化體系為添加10%胎牛血清、1%ITS（胰島素、轉鐵蛋白、硒）+1、0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L抗壞血酸磷酸鹽、1 mmol/L丙酮酸鈉、10 μg/L TGF-β3 的高糖 DMEM培養基。每3天全量換液，培養3周后，石蠟包埋，切片，進行甲苯胺藍染色鑒定。

1.9 多能干細胞分子標志檢測

收集第3代UC-MSCs，按照Trizol說明書提取細胞總RNA，取上述RNA樣品1 μL進行反轉錄反應，反應體系為20 μL，反應條件為30℃ 5 min，42℃ 40 min，95℃ 5 min。取反轉錄產物5 μL進行PCR擴增，檢測多能干細胞標志基因Oct-4、Sox-2、NanogmRNA表達水平。Oct-4 Sox-2，Nanog，和內參β-actin所用引物序列，退火溫度及產物長度（表1）。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統分析。

2 結果

2.1 UC-MSCs形態學觀察

培養7～10 d左右有少量細胞沿組織塊周邊爬出，倒置顯微鏡可見貼壁細胞呈梭形、多角形。16～21 d以后增長速度增快，可見成纖維細胞樣集落形成，此后增生成為形態相對均一的梭形細胞，呈平行排列生長或旋渦狀生長，于第3周可形成大于80%匯合貼壁細胞層（圖1）。

表1 引物序列、退火溫度及PCR擴增產物長度Table 1 Primer sequences，primer annealing temperatures and sizes of PCR products

圖1 原代臍帶間充質干細胞體外培養形態學變化過程Fig 1 The morphology of UC-MSCs at primary passsage in vitro（×100）

圖2 P3代UC-MSCs免疫表型Fig 2 Imumunophenotype of UC-MSCs at P3

2.2 UC-MSCs的免疫表型分析

貼壁細胞均表達CD105、CD73和CD105，不表達造血細胞表型CD34、CD45和HLA-DR，由此初步說明，從臍帶分離出來的貼壁細胞為間充質干細胞（圖2）。

2.3 UC-MSCs的生長曲線

UC-MSCs生長曲線基本符合細胞生長曲線規律，分為潛伏期、對數期、平臺期，分別為1、2～6和7 d后。提示UC-MSCs在體外增殖相對穩定，生長狀態無異常。細胞增殖較快，在對數生長期，細胞倍增時間均約為（24.04±0.49）h（圖3）。

圖3 P3代臍帶間充質干細胞生長曲線Fig 3 Growth curve of UC-MSCs at passage 3

2.4 UC-MSCs的細胞周期分析

UC-MSCs的細胞周期分析:81.56% 細胞在G0～G1期和18.44%細胞在S+G2+M期（圖4）。

圖4 P3代UC-MSCs的細胞周期Fig 4 Cell cycle analysis of UC-MSCs at passage 3

2.5 UC-MSCs的的分化潛能

脂肪誘導7 d倒置顯微鏡下即可見胞漿有脂滴形成，第14天油紅-O染色呈強陽性（圖5A）;成骨誘導第14天實驗組茜紅素陽性（圖5B）;軟骨誘導分化3周，甲苯胺藍染色陽（圖5C）。

圖5 P3代UC-MSCs的多向分化潛能Fig 5 Multidifferentiation potential of UC-MSCs at passage 3

多能干細胞分子標志第3代UC-MSCs表達多能干細胞的標志Oct-4，Sox-2，NanogmRNA水平（圖6）。

圖6 P3代UC-MSCs Nanog，Oct-4，Sox-2 mRNA表達Fig 6 Evaluation of pluripotent markers Nanog，Oct-4，Sox-2 mRNA abundance by RT-PCR

3 討論

近年來研究表明MSCs具有免疫調節及組織損傷修復等功能，有望在臨床治療移植物抗宿主病、自身免疫性疾病、組織修復等疾病。研究表明臍帶成為間充質干細胞新的來源，具有很大的應用前景，因此尋找一種新的分離方法成為許多學者研究的熱點［5－8］。本研究采用臍帶組織貼壁法成功從整條臍帶分離出MSCs。采用本方法分離的原代細胞多于7～10 d從剪碎臍帶組織爬出，呈梭形、多角形，于第3周左右可形成大于80%匯合貼壁細胞層。連續傳20代，細胞形態無明顯改變。細胞形態具有均一地成纖維細胞形態，增殖能力強。15代內細胞表面標志無明顯改變，表達CD73、CD90和CD105，不表達CD34、CD45和HLA-DR，這與骨髓源 MSCs表型一致［9］。大部分MSCs為早期細胞，具有典型的干細胞增殖特點。生長曲線繪制顯示細胞增殖較快，在對數生長期，細胞倍增時間短于成人骨髓源地MSCs［10］，表明臍帶MSCs有更強地增值能力，為短期內擴展出臨床所需要的細胞提供了保障。

MSCs的鑒定尚無特異性的表面標志，除免疫表型外，還要研究其多向分化能力（成脂肪、成骨和成軟骨分化）。在特定地誘導體系下，UC-MSCs能夠向脂肪、成骨和軟骨細胞分化，表明其具有多向分化潛能，證實了從臍帶所分離出來的細胞為MSCs，符合間充質干細胞國際定義標準［11］。

研究表明胚胎干細胞表達多能干細胞標志，如Oct-4 Nanog和Sox-2，它們能夠維持細胞的未分化多能性及多向分化潛能，其表達下降能夠導致干細胞失去多能性及自我更新［12］。本研究發現該組織貼壁法分離出來的UC-MSCs表達Oct-4、Nanog及Sox-2，這表明UC-MSCs具有更原始的多能干細胞特性，這可能為說明UC-MSCs增殖能力強的原因之一，因此組織貼壁法能夠分離出更為原始的UC-MSCs。

總之，組織貼壁法為一種從整根臍帶中分離培養MSCs簡單有效的方法，克服了酶消化法一些缺點，具有更強的增殖能力，且能夠體外穩定培養，為建立間充質干細胞庫及其臨床應用奠定了理論依據。

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Isolation and characterization of mesenchymal stem cells derived from whole human umbilical cord by applying a direct explant technique

ZHANG Hao1，2，ZHANG Bin2#，CHENG Mei1，TAO Yan-Ling1，HU Jiang-Wei2，XUN Man2，CHEN Hu2*

（1.Harbin Institute of Hematology ＆ Oncology，First Hospital of Harbin，Harbin 150010;2.Dept.of Hematopoietic Stem Cell Transplantation，the Affiliated Hospital to Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China）

ObjectiveTo establish a technique for isolating mesenchymal stem cells from umbilical cord and their biological characteristics.MethodsMesenchymal stem cells（MSCs）were isolated from umbilical cord（UC）by applying a explant technique and explanding culturedin vitro.Growth curves were drawn，and The phenotypes and cell cycle were evaluated by flow cytometry.UC-MSCs were induced to differentiate into adipocytes，osteocytes and chondrocytes in special differentiation condition.Mutidifferentiation related genes and stem cell-related transcription factors，Nanog，Oct-4 Sox-2were detected by TR-PCR.ResultsUC-MSCs were isolated using a explant technique，and characteristic of plastic adherence and fibroblast-like morphology.the adherent cells displayed an abundant presence of CD73，CD90，CD105 and absence of CD34，CD45，HLA-DR.Cell cycle showed that there were percentages of stem cells as G0/G181.56%and S+G2+M 18.44%respectively.When cultured in differentiation media，they differentiated into adipocytes，osteocytes and chondrocytes.RT-PCR reactions confirmed that their mutidifferentiation related genes were positive.Moreover，stem cell-related transcription factors，Nanog，Oct-4 Sox-2were positively expressed in UC-MSCs.ConclusionsThe explant technique is a feasible method to obtain MSCs from whole human umbilical cord，and UC can be considered as a novel and convenient source of adult MSCs displaying primitive pluripotent sten cells and high expansion potential.

umbilical cord;mesenchymal stem cell;differentiation

R 331.22

A

1001-6325（2012）01-0071-06

2011－10－13

2011－11－28

國家高技術研究發展計劃項目（863項目）（2011AA020114）;軍隊臨床高新技術重大項目（2010gxjs100）;黑龍江省衛生廳科研課題（2011－518）;首都臨床特色應用研究（Z111107058811107）;哈爾濱市科技創新人才研究專項基金（2009RFQQS027）;

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