基于TaqMan探針的豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立＊

祝秀梅，馬全英，杜 平，王 凡，呂志慧，牟克斌

豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒 （Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）于1987年首先出現(xiàn)于美國［1］，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起。其癥狀主要表現(xiàn)為懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及仔豬感染后的成活率下降。PRRS的一顯著特性是具有高度傳染性，1987年在北美首次爆發(fā)后，迅速在全球蔓延［2－3］，給畜牧業(yè)的發(fā)展帶來了嚴(yán)重的危害。十多年來，因它給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失而引起了科學(xué)界的關(guān)注。2006年在我國暴發(fā)的高熱病，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的破壞，由于診斷不及時(shí)，未做好應(yīng)對(duì)工作，使許多中小型豬場因此倒閉，養(yǎng)殖戶損失慘重［4－5］。因此建立快速有效實(shí)用的診斷方法是防制PRRS流行的重要環(huán)節(jié)。目前的診斷方法存在操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)、靈敏度或特異性不強(qiáng)等缺點(diǎn)。普通RT-PCR易出現(xiàn)假陽性，且核酸染色劑（溴化乙錠，EB）對(duì)人體健康有很大的危害。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）具有敏感性和特異性高、重復(fù)性和穩(wěn)定

性好、耗時(shí)短、無污染的特點(diǎn)，已成為核酸定量檢測的首選方法而得到廣泛應(yīng)用［6－8］。本研究選用PRRSV中的最保守的ORF7基因，設(shè)計(jì)引物和探針，建立了檢測PRRSV的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR，并對(duì)體系進(jìn)行了優(yōu)化。分別進(jìn)行特異性、敏感性、穩(wěn)定性試驗(yàn)，并對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測，建立了可準(zhǔn)確、快速檢測PRRSV的方法。

1 材 料

1.1 毒株 PRRSV SY0608細(xì)胞毒均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存PCV-2、CSFV、HCV、PRV、PPV細(xì)胞毒均為本實(shí)驗(yàn)室保存；臨床樣品采自周邊地區(qū)豬場。

1.2 試劑與儀器 病毒基因組RNA提取試劑盒購自 QIAGEN 公司，Premix ExTaqTM、T4DNA ligase、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ex-Taq聚合酶、pMD-18T、DNA Marker等均購自TaKaRa（大連）公司；DNA膠回收試劑盒購自Promega公司；熒光定量PCR儀為StrataGen公司產(chǎn)品（Mx3000P）。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上下載的PRRSV基因組全序列進(jìn)行比對(duì)，找出PRRSV ORF7相對(duì)保守的區(qū)域，設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針，并送至寶生物工程（大連）有限公司合成。引物、探針序列如下。

2 方 法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備

2.1.1 ORF7基因的擴(kuò)增 按照QIAGEN RNA提取試劑盒說明書，從PRRSV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中提取病毒全基因組RNA，用寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的Oligo（dT）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA為模板，用PRRSV上、下游引物擴(kuò)增PRRSV ORF7基因，擴(kuò)增條件為：94℃4min；94℃1min，58℃45s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃8min。反應(yīng)結(jié)束后取8μL PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。

2.1.2 ORF7基因的克隆與鑒定 將擴(kuò)增出的ORF7基因按膠回收試劑盒說明回收后與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化工程菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過抗性篩選挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜至液體混濁，用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并分別進(jìn)行酶切鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司測序。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的稀釋 用紫外分光光度計(jì)分別測定陽性重組質(zhì)粒的OD260和OD280，并計(jì)算濃度與拷貝數(shù)。將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，用于熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

2.2 不同探針濃度對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物量的影響 本試驗(yàn)采用TaKaRa公司的Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）system，是優(yōu)化好的含有酶、dNTP、Mg2＋等成分的2×預(yù)混液，按照試劑盒操作說明書進(jìn)行操作。采用25μL反應(yīng)體系，其中Premix Ex TaqTM12.5μL，PRRSV上、下游引物各0.5μL，RoxⅡ0.5μL，108拷貝/μL的重組質(zhì)粒1μL；探針濃度依次為0.05μmol；0.1μmol；0.2μmol；0.3 μmol；0.4μmol；0.5μmol 0.5μL，補(bǔ)足水至25μL。混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序按寶生物Premix Ex TaqTM中推薦的程序進(jìn)行：95℃30s，95℃5s、60℃20s循環(huán)40次。同時(shí)設(shè)立無模板的陰性對(duì)照。

2.3 熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 利用經(jīng)優(yōu)化后的PRRSV探針濃度，應(yīng)用相同的反應(yīng)程序，對(duì)10倍系列稀釋的PRRSV陽性標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行擴(kuò)增，收集熒光數(shù)據(jù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 熒光定量PCR的敏感性試驗(yàn) 取以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒作為模板并用無RNA酶水設(shè)陰性對(duì)照分析敏感性，以優(yōu)化的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。

2.5 熒光定量PCR的特異性試驗(yàn) 以PRRSV 108、107、106、105、104拷貝/μL的陽性質(zhì)粒以 及PCV-2、CSFV、HCV、PRV、PPV病毒核酸為模板，按照優(yōu)化的條件進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以檢測本方法的特異性。

2.6 熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn) 以109、108、107拷貝/μL的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，每個(gè)濃度重復(fù)3次，按照優(yōu)化的擴(kuò)增體系進(jìn)行熒光定量PCR，計(jì)算變異系數(shù)（CV%），以評(píng)價(jià)本方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

2.7 臨床樣品的檢測 采集來自周邊豬場的30份組織樣品，提取RNA，用建立的該方法及常規(guī)PCR法對(duì)上述組織樣品進(jìn)行檢測，同時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)來進(jìn)行病毒分離，分離的病毒用普通RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增。

3 結(jié) 果

3.1 ORF7基因的擴(kuò)增、克隆及鑒定結(jié)果 擴(kuò)增出的ORF7基因RT-PCR產(chǎn)物大小為105bp，與預(yù)期結(jié)果相符。擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD-18T載體上，得到的重組質(zhì)粒命名為pMD-ORF7。經(jīng)雙酶切鑒定，分別切出2690bp和105bp大小的片段結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒中含有PRRSV ORF7基因的部分核苷酸序列。

圖1 PRRSV ORF7基因PCR及雙酶切鑒定圖1，2：PRRSV ORF7基因 PCR 產(chǎn)物；3：pMD-ORF7雙酶切產(chǎn)物；M：DL2000MarkerFig.1 PRRSV ORF7gene PCR and double enzymatic digestion identification1，2：PRRSV ORF7gene PCR product；3：pMDORF7double enzymatic digestion product；M：DL2000Marker

3.2 重組質(zhì)粒濃度的測定 提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)核酸蛋白儀測定，其質(zhì)粒濃度為0.404mg/mL，OD260nm/OD280nm比值為1.83，符合純度要求。經(jīng)計(jì)算該陽性重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)為3.51×l012個(gè)拷貝/μL。

3.3 探針濃度的優(yōu)化 引物濃度以寶生物Premix Ex TaqTM中推薦的0.2μmol/L為最佳引物濃度，并以相同濃度的核酸為模板的反應(yīng)體系中，先用不同濃度范圍的探針，進(jìn)行熒光定量PCR。以循環(huán)Ct值最小，熒光強(qiáng)度增加值（ΔRn）最大為選定原則。經(jīng)優(yōu)選后探針的最佳濃度分別為0.4μmol/L。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按上述優(yōu)化的反應(yīng)條件，取109、108、107、106、105、104拷貝/μL的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，分別進(jìn)行擴(kuò)增，系統(tǒng)自動(dòng)分析軟件顯示Ct值與標(biāo)準(zhǔn)陽性模板濃度的對(duì)數(shù)之間存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.998，PCR擴(kuò)增效率為97.9%（圖2）。

圖2 濃度為109-104拷貝/μL的PRRSV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的FQPCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Concentration 109-104 copies/μL PRRSV plasmids standard amplification plot of real-time FQ-PCR for PRRSV

3.5 熒光定量PCR的敏感性試驗(yàn) 對(duì)PRRSV陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋后用熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測，結(jié)果表明質(zhì)粒濃度為3.51拷貝/μL時(shí)，仍能出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，顯示出良好的敏感性。

3.6 熒光定量PCR的特異性試驗(yàn) PRRSV 3.51×108、3.51×107、3.51×106、3.51×105、3.51×104拷貝/μL 的陽性質(zhì)粒以及 PCV-2、CSFV、HCV、PRV、PPV的病毒核酸為模板，用建立的TaqMan熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明除PRRSV模板檢測有擴(kuò)增曲線外，其余的均為陰性，無任何交叉反應(yīng)，呈現(xiàn)出良好的特異性。

3.7 熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn) 以3.51×109、3.51×108、3.51×107拷貝/μL濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作3次重復(fù)檢測，結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測Ct值變異系數(shù)分別為0.78%、0.71%、0.78%，表明檢測方法具有較好的穩(wěn)定性（表1）。

表1 FQ-PCR的重復(fù)性試驗(yàn)Tab.1 Repeatability test of real-time FQ-PCR for PRRSV

3.8 臨床樣品的檢測 30份臨床樣品中用本研究中建立的FQ-PCR方法檢測出28份樣品為陽性，而用常規(guī)PCR方法檢測僅有25份為陽性。對(duì)常規(guī)PCR檢測為陽性的樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測也為陽性。對(duì)常規(guī)PCR檢測為陰性的5份樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測，有3份樣品為陽性。病毒分離的結(jié)果則與FQ-PCR法檢測得到的結(jié)果完全一致，說明，建立的方法可以很好的用于臨床樣品的診斷。

4 討 論

PRRSV ORF7編碼核衣殼蛋白，即N蛋白，它是PRRSV最小的結(jié)構(gòu)蛋白，相對(duì)的保守，也是免疫原性最強(qiáng)的蛋白，在病毒粒子中含量較高，約占病毒蛋白總量的20%～40%［9］。N蛋白包括對(duì)所有毒株保守的共同表位，又有對(duì)美、歐洲型分離株特異的表位。國外，有許多研究者制備了多株N蛋白的單克隆抗體對(duì)其抗原表位進(jìn)行研究，結(jié)果表明歐洲分離株和美洲分離株的N蛋白具有高度保守的抗原表位［10－12］。由于豬感染PRRSV后，動(dòng)物機(jī)體首先產(chǎn)生的是針對(duì)N蛋白的抗體，并且抗體在體內(nèi)的存留時(shí)間較長，可以根據(jù)N蛋白抗體的水平的高低，對(duì)機(jī)體的發(fā)病情況和免疫水平做出合理的評(píng)價(jià)，因此，N蛋白可作為PRRSV抗體檢測的診斷抗原［13］。本研究選用相對(duì)保守的N蛋白，建立了檢測PRRSV的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示，所建立的檢測方法能特異、靈敏地對(duì)PRRSV進(jìn)行快速檢測，為PRRSV的快速診斷方法的研究奠定了基礎(chǔ)。

試驗(yàn)證實(shí)該方法特異性強(qiáng)，不與其他任何病原發(fā)生假陽性反應(yīng)；靈敏度高，檢測靈敏度可達(dá)3.51拷貝/μL。用該方法初步用于臨床疑似病料的檢測中，并與常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：與常規(guī)RT-PCR相比較，本試驗(yàn)所建立的方法不但可以定性檢測PRRSV，還可以定量檢測PRRSV，而且能夠檢測出常規(guī)RT-PCR無法檢測的病料，同時(shí)也免去了DNA水平電泳的步驟，更加省時(shí)，且操作簡單。因此，該方法具有快速、靈敏、特異、定性、定量等優(yōu)點(diǎn)。

國內(nèi)將熒光定量PCR應(yīng)用于PRRSV的檢測已有報(bào)道。楊宗照等［14］建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測高致病性PRRSV，該方法能快速、簡便地檢測到HP-PRRSV的存在。楊春華等［15］等建立了檢測PRRSV的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，該方法檢測靈敏度可達(dá)10拷貝/μL，并具有良好的特異性和重復(fù)性。但這些建立的方法均采用了SYBR Green染料法，該方法雖然在操作中更加簡便，但熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽性信號(hào)，從而造成特異性低。而本研究中運(yùn)用了TaqMan技術(shù)建立了檢測PRRSV的實(shí)時(shí)熒光PCR，一方面提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，另一方面又提高了檢測的特異性。

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