TaqMan探針實時熒光定量PCR快速檢測土拉弗朗西斯菌＊

趙素慧，王春暉，周 瑩，韋 耀，韓桂圓，鈕紅岺，趙 衛，張其威，萬成松

土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）能引起土拉熱（野兔熱），革蘭陰性，無孢子［1］。根據生化性質、毒力和地理分布，分為4個亞種，土拉熱亞種（F.tularensissubsp.tularensis）主要集中在北美地區，全北區亞種（F.tularensissubsp.holarctica）主要分布在北美、歐洲和亞洲［1－2］，中亞細亞（F.tularensissubsp.mediaasiatica）與新兇手亞種（F.tularensissubsp.novicida）主要分布在北美洲，在澳大利亞也有所發現［3－4］，我國以全北區亞種為主［5］。1957年，我國在黃鼠體內分離到土拉弗朗西斯菌。1959年黑龍江省報道了第一起人間 “野兔熱”［6］。1986年山東某肉類加工廠暴發了人間“野兔熱”［7］。土拉弗朗西斯菌以節肢動物叮咬、空氣和接觸傳播為主［8］，通過黏膜或昆蟲叮咬侵入臨近組織，引起炎癥病變反應，在巨噬細胞內寄生，并擴散到全身淋巴和組織器官，引起淋巴結壞死和肝脾膿腫，在臨床上表現為發熱、黃瘟等，嚴重者死亡。

本研究選擇具有良好抗原性的土拉弗朗西斯菌FopA外膜蛋白［9］人工合成fopA基因保守序列，旨在建立一種靈敏度高、特異性強、快速準確地檢測土拉弗朗西斯菌的TaqMan探針熒光定量PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與樣品 傷寒沙門菌“H”株（H901 50097）和炭疽芽孢桿菌減毒株（63002）由北京軍事醫學科學院惠贈；金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、腸出血型大腸埃希菌O157∶H7（883）和DH5ɑ由本實驗室保存，所有細菌操作均在二級生物安全實驗室（BSL-2）內進行。土拉弗朗西斯菌陽性模擬模板（fopA基因保守序列）由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.2 試劑與耗材 pUC57（Amp＋）載體為 Promega公司產品；質粒小提試劑盒為Omega Bio-Tek公司產品；Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）為TaKaRa公司產品，DNA marker、2×Taq Master Mix為OMEGA公司產品；TE溶液、LB肉湯和瓊脂平板培養基等自行配制。

1.1.3 儀器 美國GE Ultrospec 1100pro蛋白核酸檢測儀、德國Bio-Rad T-gradient梯度PCR儀、英國UVItec凝膠成像分析系統、美國Stratagene實時熒光定量PCR儀Mx3005P、上海一恒THZ-100恒溫搖床和生化培養箱等。

1.2 方法

1.2.1 設計fopA基因引物與探針 根據Larsson等土拉弗朗西斯菌外膜蛋白fopA基因序列（Gen-Bank登錄號：CP000437.1；CP000915.1；CP000439.1），利用DNAMAN軟件進行同源性分析，確定該基因在土拉弗朗西斯菌內的保守片段。采用Primer Premier 5.0軟件和Beacon Designer軟件設計2條PCR引物（PF、PR）和1條 TaqMan探針，在 Taq－Man探針的5′端標記熒光基團FAM，3′端標記淬滅基團BHQ（如表1所示）。引物和TaqMan探針由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 土拉弗朗西斯菌外膜蛋白fopA基因上的引物和TaqMan探針序列Tab.1 Sequences of primers and TaqMan probe for gene fopA

1.2.2 構建fopA標準質粒 土拉弗朗西斯菌為嚴格管控菌種，菌體樣本較難獲得。本研究根據GenBank上的fopA基因序列，參考擴增序列位置，人工合成一條121bp基因序列。以合成基因為模板，以PF、PR（見表1）為引物，PCR擴增，產物回收、純化，連接到pUC57（Amp＋）載體，制備重組質粒，后轉化到DH5ɑ感受態細胞，增殖培養，經質粒小提試劑盒抽提回收，利用蛋白核酸檢測儀測定重組質粒濃度和純度，PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 制作標準曲線 對重組質粒進行10倍梯度濃度稀釋，以不同稀釋濃度的質粒為模板，以PF、PR為引物進行QF-PCR檢測。優化的反應體系為Premix Ex TaqTM10.0μL、上下游引物和熒光探針（10μmol/L）各0.5μL、ROX Reference DyeⅡ0.5μL、DNA 模板2.0μL、去離子水6.0μL，共20.0μL。95℃預變性30s，以95℃10s，60℃60s（收集FAM熒光信號），擴增40個循環，反應時間約79min。檢測各梯度標準品的Ct值，以質粒拷貝數為橫坐標，Ct值為縱坐標建立質粒標準曲線。

1.2.4 檢測QF-PCR靈敏度 將已知拷貝數的重組質粒用TE溶液進行10倍梯度極限稀釋，以3.06×103～3.06×1010拷貝數的重組質粒模板分別進行QF-PCR和普通PCR檢測，并用2.0%的凝膠電泳檢測。比較兩種方法對基因片段的最低檢出限。

1.2.5 檢驗QF-PCR特異性 以含重組質粒的DH5ɑ工程菌為陽性樣品，以傷寒沙門菌、炭疽芽孢桿菌減毒株、金黃色葡萄球菌、腸出血型大腸埃希菌等細菌作為陰性對照菌株，再用以上細菌與DH5ɑ工程菌的混合培養液作為模擬樣品，以去離子水作為無模板空白對照（No template control，NTC）。瓊脂平板常規培養細菌，挑單菌落轉到LB液體培養基，200r/min震蕩培養12～16h，最后將菌液稀釋100倍，制作樣本。普通PCR（95℃預變性10 min，95℃10s，60℃30s，擴增45個循環，終延伸72℃5min，反應時間約71min）和 QF-PCR（95℃預變性10min，95℃10s，60℃收集FAM熒光信號30s，擴增45個循環，反應時間約75min），比較最小檢測限度。

1.2.6 QF-PCR重復性實驗 以拷貝數為3.06×106的重組質粒作為檢測模板，相同條件分別進行5組重復檢測試驗（每組3個平行），取Ct值平均數，得出Ct值變異系數，來初步評估該方法的重復性和重現性。

2 結 果

2.1 陽性樣品的制備與鑒定 人工合成fopA基因片段后，克隆到pUC57（Amp＋）載體，制成重組質粒，經抽提檢測，重組質粒濃度為93.45ng/μL，作為陽性樣品標準品。根據Avogadro's Number計算，重組質粒的拷貝數為3.06×1010copies/μL。取稀釋的重組質粒作為模板，用上下游引物進行PCR擴增，2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖1所示，在100bp附近可見一條帶，大小為121bp，與預期一致。

2.2 QF-PCR標準曲線 利用優化的反應體系，對5個10倍梯度稀釋的定量標準品進行QF-PCR檢測，結果如圖2所示。質粒拷貝數為橫坐標，Ct值為縱坐標，制作標準曲線，在3.06×103～3.06×109拷貝數間有良好的線性關系，相關系數為0.994，擴增效率為104.8%，得出標準品拷貝數與Ct值的線性方程為：Ct＝-3.213×LOG（copies）＋41.32。對樣品進行檢測，根據其Ct值和線性方程可獲得該樣品DNA拷貝數。

2.3 QF-PCR靈敏度 將已知拷貝數的重組質粒進行10倍梯度極限稀釋，對3.06×106～3.06×101拷貝數標準品質粒分別進行QF-PCR和普通PCR檢測，結果如圖3所示。QF-PCR檢測方法最低能檢測到3.06×101個DNA拷貝數，而普通PCR只能檢測到3.06×106個DNA拷貝數。

圖1 土拉弗朗西斯菌fopA基因擴增片段鑒定M.100bp DNA Ladder marker；1.擴增的目的片段（121bp）；2.無模板空白對照Fig.1 Identification of fopAgene amplification clipsM：100bp DNA Ladder marker；1：PCR amplification product（121bp）；2：NTC

圖2 標準品質粒QF-PCR擴增曲線A：標準品質粒動力學曲線B：標準品質粒標準曲線Fig.2 Amplification curve of standard plasmids by QF-PCRA：QF-PCR dynamic curve of recombinant plasmids；B：Standard curve of plasmids

2.4 QF-PCR特異性 利用本實驗建立的土拉弗朗西斯菌QF-PCR檢測方法，對4株血液、水源、接觸途徑傳播的細菌與土拉弗朗西斯菌標準品進行檢測，結果顯示，只有含fopA基因擴增片段的2個樣品出現典型的擴增曲線，其余與空白對照均為一平直線，無Ct值，如圖4所示，判斷為陰性。該結果與普通PCR檢測結果完全一致，如圖5所示，兩者比較結果如表2所示。

2.5 QF-PCR的重復性 為評估該方法的重復性和重現性，本研究對拷貝數為3.06×106的重組質粒在相同實驗條件下分別進行5組重復檢測試驗（每組3個平行），取Ct值平均數，最后得出Ct值變異系數，并統計獲得的Ct值。結果顯示，標準差為0.201，變異系數為0.88%，表明本實驗建立的土拉弗朗西斯菌QF-PCR檢測方法重現性較好，可對土拉弗朗西斯菌樣品進行穩定、可靠的檢測。

圖3 土拉弗朗西斯菌QF-PCR和普通PCR檢測的極限濃度A：QF-PCR檢測結果；B：普通PCR檢測結果。M：100bp DNA Ladder marker；1～7：拷貝數為3.06×109～3.06×103的標準品質粒；8：無模板空白對照Fig.3 Detection limit of F.tularensis by QF-PCR and conventional PCRA：QF-PCR result；B：Conventional PCR result；M：100bp DNA Ladder marker；1-7：Plasmids copies of 3.06×109-3.06×103；8：NTC

圖4 土拉弗朗西斯菌QF-PCR特異性實驗結果1.DH5ɑ工程菌（121bp）；2.DH5ɑ混合菌a a.DH5ɑ混合菌是指含土拉弗朗西斯菌模板的DH5ɑ菌與金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、炭疽芽孢桿菌及大腸埃希菌混合后形成的模擬樣品。Fig.4 Specificity of F.tularensis by QF-PCR1：DH5ɑ（121bp）；2：DH5ɑmixa；a：Mixed bacteria of DH5ɑrefers to the cultured DH5ɑ，Staphylococcus aureus，Typhoid bacillus，Bacillus anthracis，and E.coli.

圖5 土拉弗朗西斯菌普通PCR特異性實驗結果M.50bp DNA Ladder marker；1.DH5ɑ 工 程 菌（121bp）；2.DH5ɑ混合菌a；3.金黃色葡萄球菌；4.傷寒沙門菌（H901）；5.炭疽芽孢桿菌減毒株；6.EHEC O157∶H7 883；7.無模板空白對照a.DH5ɑ混合菌是指含土拉弗朗西斯菌模板的DH5ɑ菌與金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、炭疽芽孢桿菌及大腸埃希菌混合后形成的模擬樣品Fig.5 Specificity of F.tularensis by PCRM：50bp DNA Ladder marker；1：DH5ɑ （121bp）；2：DH5ɑmixa；3：Staphylococcus aureus；4：Typhoid bacillus （H901）；5：Bacillus anthracis；6：EHEC O157∶H7 883；7：NTCa：The mixed bacteria of DH5ɑrefer to the cultured DH5ɑ，Staphylococcus aureus，Typhoid bacillus，Bacillus anthracis，and E.coli.

表2 土拉弗朗西斯菌QF-PCR特異性實驗結果Tab.2 Specificity of F.tularensis by QF-PCR

3 討 論

土拉弗朗西斯菌具有高傳染性，嚴重威脅公共衛生安全，美國CDC將其歸為A類重要細菌，美軍把其列入為重要的生物戰劑目錄［10］。土拉弗朗西斯菌生長緩慢，培養條件苛刻，現今常用細菌培養及ELISA等檢方法，但耗時耗材，易造成實驗室感染，極不安全。

本研究利用QF-PCR技術，選擇土拉弗朗西斯菌外膜蛋白的特異性基因fopA作為靶基因，選取其中一段保守片段設計引物和探針，構建重組質粒，作為標準品和模擬陽性標本，在TaqMan探針的5′端標記熒光基團FAM，3′端標記淬滅基團BHQ，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，對人工模擬的土拉弗朗西斯菌進行定量檢測分析，以實現對未知樣品中土拉弗朗西斯菌的定性定量檢測。

本實驗所建立的QF-PCR技術的靈敏度達到30.6個DNA拷貝數水平，比普通PCR 3.06×106檢測靈敏。重復性試驗結果顯示，同一濃度的15個樣品檢測Ct值變異系數為0.88%，說明該方法重復性好，能保證對樣品進行穩定、可靠的檢測。同時QF-PCR過程中無需電泳檢測、不使用溴化乙錠，保障了實驗人員的安全，結合菌落PCR技術更是簡化了細菌基因組提取的繁瑣步驟。從樣品送檢到QFPCR反應完成只需2h，比常規的細菌培養、免疫檢測等方法縮短了檢測時間，降低損耗，提高檢測效率。

本研究在無法獲得該細菌樣本的條件下，通過人工合成土拉弗朗西斯菌fopA基因的特異保守序列，構建重組質粒，作為檢測的模擬陽性樣品，設計引物和探針，與普通PCR進行比較，研究QF-PCR方法的靈敏度和特異性，從而為一些高度危險、難以獲得樣品的生物戰劑級微生物的定性定量檢測建立了一套快速、靈敏和特異的QF-PCR檢測方法。

實驗結果證明，fopA基因的QF-PCR檢測特異性好，檢測速度快，靈敏度高，比ELISA等其他快速檢測方法具有明顯優勢。本研究建立的方法為土拉弗朗西斯菌的快速定量檢測和流行病學調查提供了新的實驗室檢測手段，適用于進出口物品檢驗檢疫、生物安全應急檢測（尤其是血液樣品）、致病菌的臨床診斷以及生物安全防護等領域，應用前景廣闊。

［1］Ellis J，Oyston PC，Green M，et al.Tularemia［J］.Clin Microbiol Rev，2002，15（4）：631-646.DOI：10.1128/CMR.15.4.631-646.2002

［2］Brenner DJ，Krieg NR，Staley JT，et al.Bergey's Manual of Systematic Bacteriology，vol.2 （The Proteobacteria），part B（The Gammaproteobacteria）［M］.2ndEdition.New York：Springer，2005，200-210.

［3］Forsman M，Sandstr?m G，Sj?stedt A.Analysis of 16Sribosomal DNA-sequences ofFrancisellastrains and utilization for determination of the phylogeny of the genus and for identification of strains by PCR［J］.Int J Syst Bacteriol，1994，44（1）：38-46.DOI：10.1099/00207713-44-1-38

［4］Whipp MJ，Davis JM，Lum G，et al.Characterization of a novicida-like subspecies ofFrancisella tularensisisolated in Australia［J］.J Med Microbiol，2003，52（Pt 9）：839-842.DOI：10.1099/jmm.0.05245-0

［5］Wang YH，Hai R，Zhang ZK，et al.Preliminary study and phylogenetic analysis of the subspecies ofFrancisella tularensisin China［J］.Chin J Vector Biol Control，2011，22（1）：8-10.（in Chinese）王艷華，海榮，張志凱，等.初步研究我國土拉菌的亞種及遺傳進化關系［J］.中國媒介生物學及控制雜志，2011，22（1）：8-10.

［6］Kang CG.Epidemiological survey report of first appearance of human infected with tularemia in China［J］.J Epidemiol，1980，1（4）：248-250.（in Chinese）康成貴.我國首次出現人間土拉弗氏菌病的流行病學調查報告［J］.流行病學雜志，1980，1（4）：248-250.

［7］Jiang JT，Chen FR，Yang YH，et al.Investigation on human infected withF.tularensisin Shandong Province［J］.Chin J Zoonoses，1990，6（6）：48-49.（in Chinese）姜居堂，陳福榮，楊裕華，等.山東省人間土拉弗氏菌病感染情況調查［J］.中國人獸共患病雜志，1990，6（6）：48-49.

［8］Kugeler KJ，Gurfield N，Creek JG，et al.Discrimination betweenFrancisella tularensisandFrancisella-like endosymbionts when screening ticks by PCR［J］.Appl Environ Microbiol，2005，71（11）：7594-7597.DOI：10.1128/AEM.71.11.7594-7597.2005

［9］Fulop M，Manchee R，Titball R.Role of lipopolysaccharide and a major outer membrane protein formFrancisella tularensisin the induction of immunity against tularemia［J］.Vaccine，1995，13（13）：1220-1225.DOI：10.1016/0264-410X（95）00062-6

［10］Mitchell JL，Chatwell N，Christensen D，et al.Development of real-time PCR assays for the specific detection ofFrancisella tularensisssp.tularensis，holarcticaandmediaasiatica［J］.Mol Cell Probes，2010，24（2）：72-76.DOI：10.1016/j.mcp.2009.10.004