飼用酸化劑中甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸的同步測定

索德成 李蘭 樊霞

（中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081）

飼用酸化劑是指能夠酸化飼料的一類物質。最初應用酸化劑僅作為改善飼料適口性的一種風味添加劑。隨著科學的發展，人們更深認識到飼用酸化劑不僅可改善消化道pH值環境，保障動物有良好的消化環境，還能使飼料各組分在體內被充分消化吸收，保證有益菌群合理生長，病原微生物受到有效抑制，從而達到提高動物生長性能和飼料利用率、增強機體抗病能力的效果[1-3]。近幾十年來，隨著公眾對飼用抗生素危害意識的提高，停用或減少抗生素作促生長劑的使用已成為必然的趨勢。酸化劑被視為在豬飼料中能有效替代抗生素的產品之一，在動物飼養中得到廣泛應用[4]。目前酸化劑不僅應用在仔豬生產中，在家禽、反芻動物上也有積極的效果。

市場也出現了各種類型的酸化劑。為了更好的掌握飼料酸化劑的產品質量和其中有機酸的含量，規范飼料酸化劑的生產和使用，需要建立一種簡單、快速、準確的有機酸的檢測方法。國內外報道的有機酸的檢測方法主要有電位滴定法、毛細管電泳法[5-6]、氣相色譜法[7-13]、液相色譜法[14-19]等。氣相色譜法適用于少量沸點較低的有機酸。測量高沸點的酸要用硅烷化試劑衍生樣品，方法繁瑣，操作比較復雜；對熱穩定性差和含量極低的有機酸難以測定。高效液相色譜法具有分析范圍廣、分析速度快等優點，在環境樣品、食品、飼料酸化劑等有機酸成分分析中均有應用[14-19]。但對甲酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、丙酸的同步分離分析未見報道，本實驗建立了利用液相色譜同步測定飼料酸化劑中5種有機酸的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

BP310S/310 g型分析天平(賽多利斯公司，德國)；超聲器(江蘇金壇市醫療儀器廠生產)；Aglinet 1100型高效液相色譜（美國 Aglinet公司）：帶有紫外檢測器；Grom-sil分析色譜柱：250 mm×4.0 mm，粒徑 5 μm(美國Grace公司生產)；甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸標準品:含量大于98%,購置于德國Dr.Ehrenstorfer公司；其他試劑均為分析純試劑，實驗用水為Mili-Q純化后的超純水（＞18 MΩ）；硅酸鈣載體由市場購得。

1.2 樣品前處理

稱取適量樣品0.3～1.0 g（根據樣品中各種酸的濃度）加入100 ml容量瓶中，加入2/3去離子水，超聲提取30 min，用水定容至刻度。過0.45 μm微孔濾膜，上高效液相色譜測定。

1.3 色譜條件

色譜柱：Grom－Sil柱（250 mm×4.0 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl；流動相：pH 值 2.5 磷酸水溶液；流速為 1.0 ml/min；檢測波長：210 nm。

2 結果與討論

2.1 色譜條件

影響有機酸分離效果主要在于色譜柱的選擇和流動相的選擇，我們選用了Supelco gel C－610H、Agient AQ、agela ASB C18、Grom－Sil等色譜柱作為分離柱、使用不同pH值的水溶液作為基本流動相條件摸索檢測有機酸的色譜條件。實驗中發現采用C18柱分離有機酸時，乳酸和乙酸的保留時間基本一致，無法分離。采用Grom－Sil能比較好的分離5種有機酸，因此選用了Grom－Sil柱來分離。

不同的pH值、溫度對有機酸的分離影響較大，pH值過高，會導致有機酸出峰過快，無法分離。pH值過低，保留增加，峰形較差，拖尾嚴重，丙酸和檸檬酸無法分離。在pH=2～2.5的磷酸溶液可使各種酸在色譜柱中達到完全分離，從而提高各組分的分離度和分離效率。色譜溫度對有機酸的分離有很大的影響與pH值基本相同，溫度過高會導致出峰重疊。最后確定流動相為pH值2.5磷酸水溶液，柱溫為30℃。在此條件下，各種有機酸達到了良好的分離，標準溶液的色譜圖見圖1。

圖1 甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸標準溶液的色譜

2.2 提取條件選擇

甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸均易溶于水，并且酸化劑成分比較簡單，大部分成分是有機酸和無機載體（或水）的混合物。因此提取液不需進一步凈化，經濾膜過濾后就可以上機測定。

2.3 線性方程和檢出限、定量限

配置濃度為10～500 μg/ml甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸混合標準溶液，以上述條件進行檢測，以峰面積與標準溶液的濃度作標準曲線。線性實驗結果見表1，可見各種有機酸標準溶液在10～500 μg/ml的范圍內線性關系良好。

表1 有機酸線性關系

在本實驗條件下,將標準溶液連續稀釋后進行空白樣品的加標回收,根據10倍噪音的峰響應值、取樣量和進樣量,得出方法的定量限，具體結果見表1。

2.4 回收率與精密度實驗

精密稱取空白硅酸鈣載體0.5 g于100 ml棕色量瓶中，添加不同量甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸標準溶液制成含1%、10%的樣品；精密稱取空白硅酸鈣載體0.5 g，分別添加甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸標準溶液制成含30%酸化劑；另取已知含量固體酸化劑0.3 g于100 ml棕色量瓶中，添加適量甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸標準溶液使其添加濃度為1%、10%。每個樣品5個重復，按上述方法進行檢測，測得回收率和變異系數結果見表2?？梢娫?%～30%添加水平，方法回收率均大于85%，相對標準偏差為0.8%～9.9%。結果表明，該方法測定5種有機酸含量測定的準確度和精密度均表現良好。

3 實際應用

表2 添加回收率和精密度實驗結果

應用建立的方法，對從市場上獲得已知含量的飼料酸化劑進行測定，檢測結果見表3。該檢測結果表明：本方法能滿足對飼料酸化劑中甲酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、丙酸的檢測需求。

表3 已知含量的酸化劑實驗結果（%）

[1]趙先銘,曾清華,丁永忠.酸化劑的作用機理及其應用[J].中國飼料，2002,11:22-23.

[2]秦圣濤,張宏福,唐湘方,等.酸化劑主要生理功能和復合酸選配依據[J].動物營養學報,2007,1:515-520.

[3]林海丹,鄧宇翔,王松波,等.飼用酸化劑的作用機制和應用現狀[J].廣東飼料,2009,05:23-25.

[4]李祥,張子宏.飼料酸化劑替代抗生素的作用機制[J].飼料研究，2006,09:22-24.

[5]Inés Mato,Silvia Suárez-Luque,José F.Huidobro.Determination of main organic acids in grape juice and wine by using capillary zone electrophoresis with direct UV detection[J].Food Chemistry,2007,102(1):104-112.

[6]Inés Mato,José F.Huidobro,Jesús Simal-Lozano,et al.Simultaneous determination of organic acids in beverages by capillary zone electrophoresis[J].Analytica Chimica Acta,2006,565(2):190-197.

[7]王洪麗,李成云.氣相色譜法測定苜蓿青貯料中的有機酸[J].飼料工業，2008,29(16):58-60.

[8]E.Hautala,M.L.Weaver.Separation and quantitative determination of lactic,pyruvic,fumaric,succinic,malic,and citric acids by gas chromatography[J].Analytical Biochemistry,1969,30(1):32-39.

[9]Petr Verner Separation.Quantification and identification of nonvolatile organic acids in body fluids by gas chromatography[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,1998,6(2):131-150.

[10]Veronika Dufková,Radomír,Doubravka Maradová,et al.fast derivatization procedure for gas chromatographic analysis of perfluorinated organic acids[J].Journal of Chromatography A,2009,1216(49):8659-8664.

[11]李建紅,王志暢.氣相色譜法測定土壤中丙酸、蘋果酸、檸檬酸[J].東華理工學院學報，2006,04:376-378.

[12]李瓊,劉樂全,徐懷德,等.光皮木瓜中有機酸成分研究[J].西北農業學報，2008,01:207-210.

[13]任清.衍生化毛細管氣相色譜法同時測定飼料添加劑中富馬酸、乳酸和檸檬酸[J].分析化學，2002,30:304-306.

[14]龐新安,萬英.反相高效液相譜法測定果品中有機酸[J].中國食物與營養，2007,11：40-41.

[15]畢麗君，張驪，張鴻發.固相萃取高效液相色譜法分析醬油中有機酸[J].分析化學，2000,28（11）:1391-1394.

[16]Tomás Pérez-Ruiz,Carmen Martínez-Lozano,Virginia Tomás,et al.High performance liquid chromatographic separation and quantification of citric,lactic,malic,oxalic and tartaric acids using a post-column photochemical reaction and chemiluminescence detection[J].Journal of Chromatography A,2004,1026(1-2):57-64.

[17]Zohar Kerem,Ben-ami Bravdo,Oded Shoseyov,et al.Rapid liquid chromatography-ultraviolet determination of organic acids and phenolic compounds in red wine and must[J].Journal of Chromatography A,2004,1052(1-2):211-215.

[18]謝明,吳瑩瑩,侯水生.飼料有機酸化劑中乙酸、檸檬酸的高效液相色譜檢測分析[J].飼料工業，2004，25（10）:51-52.

[19]吳劍平,商軍.高效液相色譜法同時測定復合有機酸化劑中5種成分的含量[J].中國飼料，2008，14：36-39.