薄層層析分離鱘魚膽汁

陳金芳，郭振林，龔世偉，陳 蓉，陳啟明,*

(1.綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430074； 2.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074； 3.湖北省新型反應(yīng)器與綠色化學(xué)工藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074)

0 引 言

我國(guó)鱘魚商業(yè)化養(yǎng)殖始于20世紀(jì)90年代初期[1]，現(xiàn)已成為一種新興的產(chǎn)業(yè)[2].鱘魚素有“軟黃金”、“活化石”之稱，鱘魚全身是寶，利用率極高.肉可制成小包裝烤魚片、炒魚松、熏烤魚等；魚皮可制成高檔皮革，也可制膠；魚筋、魚骨、魚肚等都可做出獨(dú)具風(fēng)格的菜肴；魚骨可制成高鈣食品，對(duì)增強(qiáng)肌體免疫力、提高大腦活力、促進(jìn)人體健康有極大益處；魚鰭制作的魚翅可以與鯊魚翅媲美，具有“黑色黃金”之稱的魚卵可制成魚籽醬；魚油與內(nèi)臟中含有大量的不飽和脂肪酸、葉酸，對(duì)于防止老年癡呆、軟化心腦血管、治療燒傷有重要的療效[3-4].而鱘魚膽卻作為廢棄物而丟棄，是一種資源的浪費(fèi).

鱘魚膽汁是一種墨綠色的粘稠液體，pH值為6～7[5]，含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.8%，醇溶物為87.5%.一直以來，國(guó)內(nèi)外對(duì)魚類膽汁的研究較少[6]，研究?jī)H局限于對(duì)膽綠素、膽汁酸等成分的初步分析，對(duì)于魚類膽汁的成分及其分離的研究還鮮見報(bào)道.鑒于對(duì)魚類膽汁缺乏系統(tǒng)的科學(xué)研究，我國(guó)一直未對(duì)魚膽汁作為藥材在臨床上使用[7].如能從鱘魚膽汁中提取出其有效成分，則可充分利用廢棄的鱘魚膽汁資源，為制藥行業(yè)提供必要的原料，緩解市場(chǎng)供需缺口的矛盾.為了綜合利用鱘魚加工下腳料，提高鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的附加值和中藥產(chǎn)業(yè)臨床應(yīng)用的價(jià)值，急需開發(fā)一套有效分離鱘魚膽汁有效成分的新工藝.本實(shí)驗(yàn)的目的是考察利用最佳的展開劑分離鱘魚膽汁的可行性，為探索鱘魚膽汁分離的新工藝和合理開發(fā)藥用資源提供一定的參考基礎(chǔ)及理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑及儀器

原料：鱘魚膽汁, 湖北天峽鱘業(yè)有限公司提供;硅膠GF254,化學(xué)純; 氯仿, 分析純; 無水乙醇, 分析純; 甲醇, 分析純; 石油醚, 分析純; 乙酸乙酯, 分析純; 乙醚, 分析純; 丙酮, 分析純;甲苯, 分析純; 硫酸, 分析純；羧甲基纖維素鈉, 粘度800～1 200 mPa·s.

儀器：AL204電子分析天平, 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司生產(chǎn); DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱, 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn); KA-1000型低速臺(tái)式離心機(jī), 上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn).

1.2 鱘魚膽汁樣品液的制備

稱取鱘魚膽汁多糖2.0 g，使其溶于20 mL甲醇中，充分?jǐn)嚢栌胁糠植蝗芪铮瑢⒋巳芤恨D(zhuǎn)移至離心管中，3 000 r/min離心0.5 h，分離出黃綠色的上層清液備用.

1.3 硅膠板的制備

將75 mm×26 mm的載玻片依次用水和乙醇洗凈并晾干.稱取2.5 g CMC-Na于1 L燒杯中，加入500 mL蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌均勻，并在電爐上加熱至沸，使CMC-Na充分溶解，冷卻，配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%CMC-Na水溶液備用.稱取25.0 g硅膠GF254，與70 mL CMC-Na水溶液混合，在燒杯中調(diào)成糊狀，充分?jǐn)嚢柚翢o氣泡.用藥匙量取一定量調(diào)制好的硅膠涂勻于載玻片上，將載玻片在桌面輕震使其表面平坦光滑，薄層厚度控制在0.25 mm左右，將制備好的硅膠板在室溫條件下自然干燥，然后轉(zhuǎn)移至110 ℃的烘箱中加熱活化0.5 h，自然冷卻后放入干燥器中備用[8].

1.4 顯色劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用的顯色劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的硫酸乙醇.稱取80 g無水乙醇和20 g濃硫酸，將兩者混合均勻，放入試劑瓶中備用.

1.5 點(diǎn)樣、展開與顯色

用管口平整、內(nèi)徑為0.5 mm的毛細(xì)管吸取樣品液，并將吸取樣品的一側(cè)輕輕接觸距離硅膠板下端約10 mm處點(diǎn)板并重復(fù)多次點(diǎn)樣，觀察樣點(diǎn)為黃綠色.若同一塊薄層上需點(diǎn)多個(gè)樣點(diǎn)時(shí)，樣點(diǎn)之間距為10 mm左右，而且要保證樣點(diǎn)在同一水平線上.點(diǎn)樣后，待溶劑完全揮發(fā)再將硅膠板放入層析缸中，當(dāng)展開劑前沿到距離硅膠板上端10 mm左右時(shí)取出，將硅膠板用電吹風(fēng)吹干，此時(shí)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%硫酸乙醇溶液均勻噴灑于硅膠板上，置110 ℃烘箱中加熱3～5 min，呈現(xiàn)出紫紅色或紫色的膽汁酸斑點(diǎn).

選擇展開劑的條件:a.對(duì)欲分離組分有良好的溶解性；b.可使各組分分開，待測(cè)組分的定量測(cè)定在0.3左右，Rf值在0.2～0.8之間；c.不能與吸附劑或待測(cè)組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，沸點(diǎn)適中，黏度要小，展開后各組分斑點(diǎn)集中[9].

2 結(jié)果與討論

2.1 單元溶劑系統(tǒng)

根據(jù)溶劑對(duì)膽汁的溶解性，選用8種較常用的溶劑為展開劑，顯色后圖譜如圖1.

由圖1可知，氯仿(A)雖可分離出一種組分，但對(duì)于其中兩種組分的極性偏小；甲苯(B)可分離出其中的兩種組分；石油醚(C)可以分離極性較大的組分，但對(duì)于極性小的組分分離效果不明顯；甲醇(D)和乙酸乙酯(H)極性較大，可將膽汁中極性較小的組分展開至前沿位置；無水乙醇(E)、丙酮(G)均有不同程度的拖尾現(xiàn)象，不能分離膽汁中組分；乙醚(F)的極性最小，所有組分在原點(diǎn)未移動(dòng)；水(I)將所有組分推至溶劑前沿.無水乙醇(E)和水(I)的展開時(shí)間太長(zhǎng)，約1 h，其它溶劑的展開時(shí)長(zhǎng)約10 min.

圖1 單元溶劑系統(tǒng)的TLC圖譜Fig.1 TLC spectrum of unit solvent system注： 展開距離(點(diǎn)樣線到溶劑前沿的間距)均為56 mm；用虛線顯示拖尾；A-I表示展開劑.A．氯仿；B.甲苯；C. 石油醚；D.甲醇；E.無水乙醇；F．乙醚；G.丙酮；H.乙酸乙酯；I.水.

2.2 二元溶劑系統(tǒng)

單一溶劑不能很好地展開膽汁中各組分，則選用混合溶劑作為展開劑.首先用一種極性較小的溶劑作為基礎(chǔ)展開溶劑混合物，觀察展開效果，若不好再用極性較大的溶劑與前一種溶劑相混合，并不斷調(diào)整混合溶劑的配比，直至選出合適的展開劑組合.

乙醚是易揮發(fā)、低沸點(diǎn)的溶劑，溶劑損失較大，故不選乙醚與其它溶劑混合.參照?qǐng)D1的顯示結(jié)果，將極性較大和較小的溶劑相組合作為展開劑，顯色后如圖2.

圖2 二元溶劑系統(tǒng)TLC圖譜Fig.2 TLC spectrum of binary solvent system注： A-H表示展開劑.A.氯仿/甲醇(5∶1，體積比，下同);B. 氯仿/甲醇(10∶1);C. 氯仿/乙醇(10∶1);D.氯仿/乙醇(15∶1);E. 甲醇/乙酸乙酯(2∶1);F. 乙醇/乙酸乙酯(2∶1);G. 石油醚/丙酮(3∶1);H. 石油醚/乙酸乙酯(5∶1).

由圖2的顯示結(jié)果可知，展開劑A、B分離效果較佳；溶劑C、D、E、H均有不同程度的拖尾現(xiàn)象；溶劑F的極性最大，不能分離出膽汁中的組分.展開時(shí)間約10 min.

2.3 三元溶劑系統(tǒng)

由圖3可知，三元溶劑A、C可以分離出膽汁中的三種成分，但與二元溶劑相比，三元溶劑不易回收；溶劑D、E、F的極性略大，顯色后位于板上部有一斑點(diǎn)，這表明膽汁中某種組分已被展開至板頂；溶劑G雖可觀察到4個(gè)主斑點(diǎn)，但各組分之間均有拖尾現(xiàn)象.

圖3 三元溶劑系統(tǒng)TLC圖譜Fig.3 TLC spectrum of multiple solvent system注： A-G表示展開劑.A．氯仿/甲醇/甲苯(5∶1∶1，體積比，下同);B.氯仿/甲醇/甲苯/石油醚(5∶1∶1∶1);C.石油醚/丙酮/甲苯(3∶1∶1);D.石油醚/丙酮/乙醇(3∶1∶1);E.石油醚/甲醇/甲苯(1∶1∶1);F．氯仿/甲醇/甲苯(10∶2∶1);G．氯仿/甲醇/乙醇(5∶1∶1).

3 結(jié) 語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)中選用不同的溶劑系統(tǒng)作展開劑，對(duì)鱘魚膽汁中的有效成分進(jìn)行薄層層析分離.應(yīng)用硅膠薄層層析法分離鱘魚膽汁，篩選和優(yōu)化展開劑，作為柱層析的洗脫劑體系分離鱘魚膽汁的重要參考依據(jù).溶劑的選擇和配比對(duì)鱘魚膽汁的分離效果均有顯著的影響.如何進(jìn)一步提高膽汁中各組分的分離效果將是后續(xù)工作的重點(diǎn).整個(gè)分離過程投資少，節(jié)約能源，對(duì)后續(xù)的柱層析分離有重要的參考價(jià)值.

致謝：感謝湖北天峽鱘業(yè)有限公司提供的鱘魚膽汁等實(shí)驗(yàn)材料.

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