薄層層析分離鱘魚膽汁

陳金芳，郭振林，龔世偉，陳 蓉，陳啟明,*

(1.綠色化工過程教育部重點實驗室,湖北 武漢 430074； 2.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430074； 3.湖北省新型反應器與綠色化學工藝重點實驗室，湖北 武漢 430074)

0 引 言

我國鱘魚商業化養殖始于20世紀90年代初期[1]，現已成為一種新興的產業[2].鱘魚素有“軟黃金”、“活化石”之稱，鱘魚全身是寶，利用率極高.肉可制成小包裝烤魚片、炒魚松、熏烤魚等；魚皮可制成高檔皮革，也可制膠；魚筋、魚骨、魚肚等都可做出獨具風格的菜肴；魚骨可制成高鈣食品，對增強肌體免疫力、提高大腦活力、促進人體健康有極大益處；魚鰭制作的魚翅可以與鯊魚翅媲美，具有“黑色黃金”之稱的魚卵可制成魚籽醬；魚油與內臟中含有大量的不飽和脂肪酸、葉酸，對于防止老年癡呆、軟化心腦血管、治療燒傷有重要的療效[3-4].而鱘魚膽卻作為廢棄物而丟棄，是一種資源的浪費.

鱘魚膽汁是一種墨綠色的粘稠液體，pH值為6～7[5]，含水質量分數為86.8%，醇溶物為87.5%.一直以來，國內外對魚類膽汁的研究較少[6]，研究僅局限于對膽綠素、膽汁酸等成分的初步分析，對于魚類膽汁的成分及其分離的研究還鮮見報道.鑒于對魚類膽汁缺乏系統的科學研究，我國一直未對魚膽汁作為藥材在臨床上使用[7].如能從鱘魚膽汁中提取出其有效成分，則可充分利用廢棄的鱘魚膽汁資源，為制藥行業提供必要的原料，緩解市場供需缺口的矛盾.為了綜合利用鱘魚加工下腳料，提高鱘魚養殖業的附加值和中藥產業臨床應用的價值，急需開發一套有效分離鱘魚膽汁有效成分的新工藝.本實驗的目的是考察利用最佳的展開劑分離鱘魚膽汁的可行性，為探索鱘魚膽汁分離的新工藝和合理開發藥用資源提供一定的參考基礎及理論依據.

1 實驗部分

1.1 原料、試劑及儀器

原料：鱘魚膽汁, 湖北天峽鱘業有限公司提供;硅膠GF254,化學純; 氯仿, 分析純; 無水乙醇, 分析純; 甲醇, 分析純; 石油醚, 分析純; 乙酸乙酯, 分析純; 乙醚, 分析純; 丙酮, 分析純;甲苯, 分析純; 硫酸, 分析純；羧甲基纖維素鈉, 粘度800～1 200 mPa·s.

儀器：AL204電子分析天平, 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司生產; DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱, 上海精宏實驗設備有限公司生產; KA-1000型低速臺式離心機, 上海安亭科學儀器廠生產.

1.2 鱘魚膽汁樣品液的制備

稱取鱘魚膽汁多糖2.0 g，使其溶于20 mL甲醇中，充分攪拌有部分不溶物，將此溶液轉移至離心管中，3 000 r/min離心0.5 h，分離出黃綠色的上層清液備用.

1.3 硅膠板的制備

將75 mm×26 mm的載玻片依次用水和乙醇洗凈并晾干.稱取2.5 g CMC-Na于1 L燒杯中，加入500 mL蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌均勻，并在電爐上加熱至沸，使CMC-Na充分溶解，冷卻，配置成質量分數0.5%CMC-Na水溶液備用.稱取25.0 g硅膠GF254，與70 mL CMC-Na水溶液混合，在燒杯中調成糊狀，充分攪拌至無氣泡.用藥匙量取一定量調制好的硅膠涂勻于載玻片上，將載玻片在桌面輕震使其表面平坦光滑，薄層厚度控制在0.25 mm左右，將制備好的硅膠板在室溫條件下自然干燥，然后轉移至110 ℃的烘箱中加熱活化0.5 h，自然冷卻后放入干燥器中備用[8].

1.4 顯色劑的選擇

本實驗選用的顯色劑為質量分數20%的硫酸乙醇.稱取80 g無水乙醇和20 g濃硫酸，將兩者混合均勻，放入試劑瓶中備用.

1.5 點樣、展開與顯色

用管口平整、內徑為0.5 mm的毛細管吸取樣品液，并將吸取樣品的一側輕輕接觸距離硅膠板下端約10 mm處點板并重復多次點樣，觀察樣點為黃綠色.若同一塊薄層上需點多個樣點時，樣點之間距為10 mm左右，而且要保證樣點在同一水平線上.點樣后，待溶劑完全揮發再將硅膠板放入層析缸中，當展開劑前沿到距離硅膠板上端10 mm左右時取出，將硅膠板用電吹風吹干，此時用質量分數20%硫酸乙醇溶液均勻噴灑于硅膠板上，置110 ℃烘箱中加熱3～5 min，呈現出紫紅色或紫色的膽汁酸斑點.

選擇展開劑的條件:a.對欲分離組分有良好的溶解性；b.可使各組分分開，待測組分的定量測定在0.3左右，Rf值在0.2～0.8之間；c.不能與吸附劑或待測組分發生化學反應，沸點適中，黏度要小，展開后各組分斑點集中[9].

2 結果與討論

2.1 單元溶劑系統

根據溶劑對膽汁的溶解性，選用8種較常用的溶劑為展開劑，顯色后圖譜如圖1.

由圖1可知，氯仿(A)雖可分離出一種組分，但對于其中兩種組分的極性偏??；甲苯(B)可分離出其中的兩種組分；石油醚(C)可以分離極性較大的組分，但對于極性小的組分分離效果不明顯；甲醇(D)和乙酸乙酯(H)極性較大，可將膽汁中極性較小的組分展開至前沿位置；無水乙醇(E)、丙酮(G)均有不同程度的拖尾現象，不能分離膽汁中組分；乙醚(F)的極性最小，所有組分在原點未移動；水(I)將所有組分推至溶劑前沿.無水乙醇(E)和水(I)的展開時間太長，約1 h，其它溶劑的展開時長約10 min.

圖1 單元溶劑系統的TLC圖譜Fig.1 TLC spectrum of unit solvent system注： 展開距離(點樣線到溶劑前沿的間距)均為56 mm；用虛線顯示拖尾；A-I表示展開劑.A．氯仿；B.甲苯；C. 石油醚；D.甲醇；E.無水乙醇；F．乙醚；G.丙酮；H.乙酸乙酯；I.水.

2.2 二元溶劑系統

單一溶劑不能很好地展開膽汁中各組分，則選用混合溶劑作為展開劑.首先用一種極性較小的溶劑作為基礎展開溶劑混合物，觀察展開效果，若不好再用極性較大的溶劑與前一種溶劑相混合，并不斷調整混合溶劑的配比，直至選出合適的展開劑組合.

乙醚是易揮發、低沸點的溶劑，溶劑損失較大，故不選乙醚與其它溶劑混合.參照圖1的顯示結果，將極性較大和較小的溶劑相組合作為展開劑，顯色后如圖2.

圖2 二元溶劑系統TLC圖譜Fig.2 TLC spectrum of binary solvent system注： A-H表示展開劑.A.氯仿/甲醇(5∶1，體積比，下同);B. 氯仿/甲醇(10∶1);C. 氯仿/乙醇(10∶1);D.氯仿/乙醇(15∶1);E. 甲醇/乙酸乙酯(2∶1);F. 乙醇/乙酸乙酯(2∶1);G. 石油醚/丙酮(3∶1);H. 石油醚/乙酸乙酯(5∶1).

由圖2的顯示結果可知，展開劑A、B分離效果較佳；溶劑C、D、E、H均有不同程度的拖尾現象；溶劑F的極性最大，不能分離出膽汁中的組分.展開時間約10 min.

2.3 三元溶劑系統

由圖3可知，三元溶劑A、C可以分離出膽汁中的三種成分，但與二元溶劑相比，三元溶劑不易回收；溶劑D、E、F的極性略大，顯色后位于板上部有一斑點，這表明膽汁中某種組分已被展開至板頂；溶劑G雖可觀察到4個主斑點，但各組分之間均有拖尾現象.

圖3 三元溶劑系統TLC圖譜Fig.3 TLC spectrum of multiple solvent system注： A-G表示展開劑.A．氯仿/甲醇/甲苯(5∶1∶1，體積比，下同);B.氯仿/甲醇/甲苯/石油醚(5∶1∶1∶1);C.石油醚/丙酮/甲苯(3∶1∶1);D.石油醚/丙酮/乙醇(3∶1∶1);E.石油醚/甲醇/甲苯(1∶1∶1);F．氯仿/甲醇/甲苯(10∶2∶1);G．氯仿/甲醇/乙醇(5∶1∶1).

3 結 語

實驗中選用不同的溶劑系統作展開劑，對鱘魚膽汁中的有效成分進行薄層層析分離.應用硅膠薄層層析法分離鱘魚膽汁，篩選和優化展開劑，作為柱層析的洗脫劑體系分離鱘魚膽汁的重要參考依據.溶劑的選擇和配比對鱘魚膽汁的分離效果均有顯著的影響.如何進一步提高膽汁中各組分的分離效果將是后續工作的重點.整個分離過程投資少，節約能源，對后續的柱層析分離有重要的參考價值.

致謝：感謝湖北天峽鱘業有限公司提供的鱘魚膽汁等實驗材料.

參考文獻：

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[9] 蔣蕾. 羊膽汁與其主要成分抗炎作用及作用機制的比較研究[D]. 黑龍江：黑龍江中醫藥大學，2007.