茚三酮法定性定量檢測絲氨酸

關(guān)洪亮，熊 倩，余訓(xùn)民，李慶新

(武漢工程大學(xué)環(huán)境與城市建設(shè)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

0 引 言

隨著人們對絲氨酸生理作用的深入認(rèn)識和醫(yī)藥保健事業(yè)的不斷發(fā)展，醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)對絲氨酸的需求量正迅速擴(kuò)大.雖然L-絲氨酸屬于非必需氨基酸，但它卻具有許多重要的生理功能及用途，在醫(yī)藥、食品、化妝品中均有較為廣泛的應(yīng)用.因此，測定混合氨基酸中絲氨酸的含量對絲氨酸的開發(fā)利用具有重要意義.

α-氨基酸與茚三酮在弱酸性溶液中共熱，反應(yīng)后經(jīng)失水脫羧生成氨基茚三酮，再與水合茚三酮反應(yīng)生成紫紅色或藍(lán)色物質(zhì)，如圖1.脯氨酸等仲胺氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì).絲氨酸和茚三酮在弱酸性條件下共熱可以生成紫紅色的縮合物質(zhì)[1-3]，且其顏色隨著絲氨酸的含量變化而有所不同.

圖1 α-氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)Fig.1 Colour reaction of α-amino acid and ninhydrin

上述反應(yīng)生成的紫紅色縮合物顏色的深淺還與反應(yīng)的pH、顯色劑的用量、反應(yīng)的溫度及時(shí)間有關(guān).本文利用顯色反應(yīng)，采用比色法定量檢測絲氨酸并探討了最佳的反應(yīng)條件.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

722E可見光分光光度計(jì)；層析濾紙；毛細(xì)管；25 μL微量進(jìn)樣器；薄層色譜展開缸(規(guī)格100×100)；干燥箱；帶塞玻璃試管(比色管).

1g/L的L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.1 g絲氨酸溶于100 mL去離子水中.

展層劑：按照“正丁醇∶95%乙醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶1∶2”比例配制，均為AR.

0.1%茚三酮溶液：稱取0.1 g茚三酮溶于95%乙醇中，定容至100 mL，均為AR.

層析液(0.1%茚三酮-展層劑)：每10 mL展層劑中加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液.

洗脫液：按照“V(0.1%CuSO4)∶V(75%乙醇)=2∶38”比例配制.稱取0.156 5 g CuSO4·5H2O溶于去離子水中，定容至100 mL，配制成0.1%CuSO4溶液.

待測樣品：氨基酸混合液，含有絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸等.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茚三酮法定性檢測絲氨酸 將預(yù)先配制的層析液倒入展開缸中靜置20 min，使缸內(nèi)環(huán)境達(dá)到平衡，在距濾紙下端2 cm處劃一橫線，將待測樣品用毛細(xì)管點(diǎn)樣于橫線上，點(diǎn)樣半徑不要超過2 mm，將L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用毛細(xì)管點(diǎn)樣于距待測樣品點(diǎn)1.5 cm處的橫線上，點(diǎn)樣半徑不要超過2 mm.待樣液自然揮發(fā)干后傾斜放入展開缸中，下端1 cm左右浸入層析液中，上端高出展開缸的部分延展開缸邊緣折疊掛于展開缸上，確保濾紙不與展開缸內(nèi)壁接觸，如圖2.待層析液上行至距折線1 cm左右時(shí)取出濾紙，放入105 ℃的干燥箱中干燥5 min[4].

圖2 層析示意圖Fig.2 Diagrammatic sketch of chromatography

1.2.2 茚三酮法定量檢測絲氨酸 將預(yù)先配制的層析液倒入展開缸中靜置20 min，使缸內(nèi)環(huán)境達(dá)到平衡，在距濾紙下端2 cm處劃一橫線，用微量進(jìn)樣器取1 g/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)樣于橫線

上，待樣液自然揮發(fā)干后傾斜放入展開缸中，如圖2.待層析液上行至距折線1 cm左右時(shí)取出濾紙，放入干燥箱中，在105 ℃條件下干燥5 min.干燥后的濾紙上會呈現(xiàn)明顯的氨基酸顯色斑點(diǎn)，剪下氨基酸顯色斑點(diǎn)，將其放置于帶塞玻璃試管中(比色管)，用4 mL洗脫液洗脫35 min，再倒入比色皿中靜置24 h(確保液體中的紙末全部沉淀)，以洗脫液為對照樣，在722E分光光度計(jì)上(波長570 nm處)測定吸光度[5-6].

2 檢測結(jié)果與討論

2.1 茚三酮顯色反應(yīng)的影響因素

2.1.1 溶液pH的影響 用1 mol/L的NaOH溶液和1+1的硫酸溶液將層析液分別配制成pH為1.03、2.02、2.50、3.05、4.50的溶液，用微量進(jìn)樣器取5 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)樣，進(jìn)行層析顯色.

由于層析液在堿性條件下分層，所以用1 mol/L的NaOH溶液和1+1的硫酸溶液將1 g/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成pH為6.56、8.77、9.50、11.05、12.05，取5 μL點(diǎn)樣，將層析液配制成弱堿性溶液，進(jìn)行層析顯色[7].

實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸納于表1.

表1 pH對顯色反應(yīng)的影響Table 1 pH on the colour reaction

注： 1 g/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μL；105 ℃下烘干5 min；每10 mL展層劑加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液

由表1可知，當(dāng)溶液pH低至2.0時(shí)不顯色，從pH為2.5開始有淡紫色出現(xiàn)，但pH超過9.5時(shí)淡紅色不是很明顯，之后不再顯色，可知顯色范圍在2.50～9.50之間，α-氨基酸[1]和茚三酮的顯色反應(yīng)對介質(zhì)的pH值非常敏感.

學(xué)者研究表明：α-氨基酸和茚三酮顯色反應(yīng)中，主要的顏色產(chǎn)物均通過縮合形成.與羰基化合物和氨的衍生物之間的反應(yīng)類似，在弱酸性條件下，這種縮合反應(yīng)更容易發(fā)生[5,8]，酸性條件還能減少氨基以外的其它基團(tuán)對顯色反應(yīng)的干擾，使顯色反應(yīng)生成的顏色產(chǎn)物更穩(wěn)定.強(qiáng)酸性介質(zhì)中雖然能增強(qiáng)茚三酮或1,3-茚三酮羥基的反應(yīng)能力，但在強(qiáng)酸性條件下卻降低了參與縮合反應(yīng)的氨基、羥基等新核基團(tuán)的活性，使有色的縮合產(chǎn)物形成困難而且縮合生成的顏色產(chǎn)物在強(qiáng)酸性介質(zhì)中也不穩(wěn)定.在堿性條件下，顯色反應(yīng)需加熱才能完成，而且在離熱后，空氣中的氧分子或其他氧化物容易與還原型的有色縮合產(chǎn)物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，引起顏色變化甚至褪色.又因在堿性介質(zhì)中，很多基團(tuán)或化合物的還原能力得到加強(qiáng)，擴(kuò)大了茚三酮的顯色反應(yīng)范圍，使得副反應(yīng)增多，從而使反應(yīng)、反應(yīng)產(chǎn)物及產(chǎn)物顏色變得復(fù)雜化，在分子內(nèi)部因素和外來因素的雙重影響和干擾下，不利于茚三酮對α-氨基酸的檢驗(yàn)和測定，并且堿性介質(zhì)中顏色的不穩(wěn)定也妨礙了對α-氨基酸的準(zhǔn)確分析[5].

綜上所述，α-氨基酸和茚三酮的顯色反應(yīng)宜在弱酸性下進(jìn)行.因此，本實(shí)驗(yàn)中選定層析液的pH為4.50左右.

2.1.2 顯色劑用量的影響 取8組20 mL配制好的展層劑，分別加入0.4、1.2、2.0、2.8、3.6、4.4、5.2、6.0 mL 0.1%茚三酮溶液，作為層析液，調(diào)節(jié)層析液pH至4.50左右.用微量進(jìn)樣器取1 g/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液15 μL點(diǎn)樣于濾紙上，進(jìn)行層析[9-10].按照實(shí)驗(yàn)方法測定每個(gè)顯色體系的吸光度并繪制成圖，結(jié)果見圖3.

圖3 顯色劑用量對吸光度的影響Fig.3 Dosage of chromogenic agent on absorbance

由圖3可看出，吸光度開始時(shí)隨著顯色劑用量的增加而增大，然后趨于平衡.當(dāng)顯色劑用量為2.2 mL時(shí)，吸光度上升到最大，之后再增加顯色劑用量，吸光度基本無明顯變化，因此顯色劑用量為2.2 mL時(shí)最佳.因此，本實(shí)驗(yàn)中選擇每10 mL展層劑中加入2.5 mL顯色劑.

2.1.3 反應(yīng)溫度及時(shí)間的影響 反應(yīng)需在加熱狀態(tài)下進(jìn)行，因此反應(yīng)溫度及時(shí)間對顯色效果也存在較大影響.取4組20 mL展層劑，分別加入5 mL顯色劑并調(diào)節(jié)pH至4.50左右.用微量進(jìn)樣器取1 g/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液15 μL點(diǎn)樣于濾紙上，進(jìn)行層析[7].分別放入105、90、75、60 ℃的溫度下顯色，結(jié)果見表2.

表2 反應(yīng)溫度及時(shí)間對顯色效果的影響Table 2 Reaction temperature and time on colour effects

注： 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為1 g/L；每10 mL展層劑中有2.5 mL顯色劑.

由表2可知，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，即使加熱13 min以上也只顯出淡紫色；溫度為75 ℃時(shí)，加熱7.5 min才出現(xiàn)顏色變化；溫度為90 ℃時(shí)，加熱6.5 min就有顏色變化；當(dāng)溫度上升到105 ℃時(shí)，加熱3.7 min即出現(xiàn)明顯的顏色變化.綜合各方面的考慮，反應(yīng)的最佳條件應(yīng)選在105 ℃下加熱4～5 min.若加熱時(shí)間過長會導(dǎo)致顯色斑點(diǎn)顏色擴(kuò)散，影響吸光度的測定.

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取5組20 mL層析液，pH調(diào)至4.55，用微量進(jìn)樣器分別取1 g/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、15、20、25 μL點(diǎn)樣于層析濾紙上，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量與吸光度做絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]，見圖4.

圖4 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of serine

從圖4可知，絲氨酸用量與吸光度呈線性關(guān)系，其回歸線方程為y=0.001 7x-0.000 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 8.

2.2.2 測定方法的精密度 精密度[11]一般用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)表示.

取一定量的絲氨酸溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行多次比色測定(n=5)，計(jì)算絲氨酸含量，結(jié)果見表3.

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repetitive experimental results

注： pH為4.55；105 ℃下烘干5 min；每10 mL展層劑加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液.

由此可見，此測定方法的重復(fù)性較好，精密度較高，比較可靠.

3 結(jié) 語

茚三酮比色法定量檢測絲氨酸操作簡單、成本低.只要控制好實(shí)驗(yàn)條件，就能取得較好的測量結(jié)果.本文探討了溶液pH、顯色劑用量、反應(yīng)溫度及時(shí)間對茚三酮比色法定量檢測絲氨酸的影響，測定了絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到了最佳實(shí)驗(yàn)條件：溶液pH為4.50，顯色劑用量為每10 mL展層劑中加入2.5 mL 0.1%茚三酮顯色劑，在105 ℃下加熱5 min.

參考文獻(xiàn)：

[1] 張振華.α-氨基酸與茚三酮顯色反應(yīng)影響因素的探討[J].邵陽高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2000，13(1)：42-44.

[2] 費(fèi)格爾F.有機(jī)分析點(diǎn)滴試驗(yàn)[M].北京：燃料化學(xué)工業(yè)出版杜，1972:197-198.

[3] Ternay A L Jr.Contemporary Organic Chemistry[M]. London:W.B. Saunders co.,1979：1068.

[4] 周俊英,金谷,張賢萱,等.定量化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)[M].合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，1995.

[5] 周圓圓.毛發(fā)水解液中L-絲氨酸的分離及相關(guān)分析檢測方法的建立[D].武漢：華中科技大學(xué)，2007.

[6] 楊曉玲，趙宗云，劉永軍，等.應(yīng)用紙層析分離鑒定氨基酸方法的改進(jìn)[J].植物生理學(xué)通訊，2002,38(4):368.

[7] 王昂,王麗麗,儀宏，等.茚三酮比色法測定谷氨酸含量的研究[J].中國調(diào)味品，2005,8(8):50-52.

[8] 普戶默DT.實(shí)用生物化學(xué)導(dǎo)論[M].吳軍，譯.北京：科學(xué)出版社，1985：137.

[9] 劉飛飛,李群,于嵐.茚三酮比色法定量檢測賴氨酸條件的研究[J].中國食品添加劑，2010(5):223-225.

[10] 彭繼明,張佑紅,徐鵬,等.不同pH值條件下的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[J].武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2010,32(3):20-24.

[11] 邵金良,黎其萬,董寶生,等.茚三酮比色法測定茶葉中游離氨基酸總量[J].中國食品添加劑,2008(2):162-165.