腫節風炭疽病病原學研究及其對藥材質量的影響

蔣 妮， 唐美瓊， 藍祖栽， 黃永才， 林 楊， 白隆華

（廣西藥用植物園，廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室，南寧 530023）

腫節風［Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai]又名草珊瑚、九節茶，為金粟蘭科（Chloranthaceae）草珊瑚屬（Sarcandra）多年生草本植物，以全草入藥，具有清熱涼血、活血消斑、祛風通絡等功效，為中國藥典收錄品種［1]，同時也是廣西瑤族地區民間流傳的“七十二風”傳統瑤藥中的重要品種［2]。近年來，隨著腫節風產品的不斷開發，腫節風藥材資源日益緊俏，為此，廣西藥用植物園在廣西融安、東蘭等地開展了腫節風的規范化栽培研究工作，并在南寧建立腫節風種質資源圃。在此過程中發現植株地上部分受病害危害較為嚴重，主要在葉片上表現出褐色枯斑，引起葉片大量枯萎。目前關于腫節風葉斑類病害國內外尚未見報道，為此，筆者在腫節風種質資源圃對該病害的發生情況進行定期調查，并進行病原分離鑒定及生物學特性研究，以期為病害的識別及防治提供理論依據。

目前，關于藥用植物病害與藥材質量的關系研究報道很少。王喜軍報道龍膽斑枯病不但會造成產量損失，同時也會使藥材質量變劣，有效成分含量下降［3]。高微微等［4]研究根部病害對西洋參根不同部位主要皂苷含量的影響，結果發現：發生根病的西洋參根中人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量之和低于正常參根；其中Rb1受根病的影響最為明顯，隨著病害程度加重而顯著下降。據田間調查，腫節風炭疽病可危害植株葉、葉柄及莖，由于腫節風全株入藥，生產中感病的藥材通常也被采收入藥。研究腫節風炭疽病不同病情對腫節風產量和質量的影響，正確評價該病害對腫節風生產造成的影響，不僅利于制定防治指標，做出正確防治決策，而且對于腫節風藥材的質量控制具有重要的參考價值。

1 材料和方法

1.1 腫節風炭疽病田間發生情況調查

2008年在南寧廣西藥用植物園腫節風種質圃進行調查，每月下旬調查1次。采取隨機取樣，調查20株，每株上、中、下各查10片葉，共查600片葉。分級調查，統計病害發生率和病情指數。

參考謝玲等［5]方法制定腫節風炭疽病分級標準。

0級：葉片無病斑；

1級：病斑面積占整個葉面積的10%以下；

2級：病斑面積占整個葉面積的10%～29%；

3級：病斑面積占整個葉面積的30%～50%；

4級：病斑面積占整個葉面積的50%以上。

病情指數＝∑（病級葉片數×代表數值）／（調查葉片總數×發病最重級別的代表數值）×100。

1.2 病原菌鑒定

1.2.1 菌株分離

采摘新感病的腫節風病葉，常規組織分離法分離，將分離到的菌株單孢純化后置4℃冰箱保存備用。

1.2.2 致病性測定

采取針刺菌片接種方法接種葉片，以接種PDA培養基作為對照，在室溫（20～25℃）下保濕培養5d，記錄發病情況，對比發病后癥狀并再分離病原作柯赫氏驗證［6]。

1.2.3 形態學鑒定

將致病菌株移至PDA平板上28℃下進行培養，按玻片培養法觀察和記載病菌的形態特征［6]，結合菌落形態、病害的癥狀，參考魏景超［7]《真菌鑒定手冊》進行病原菌種屬鑒定。

1.2.4 分子鑒定

采用SDS法提取病原菌株的基因組DNA［8]。采用真菌核糖體基因轉錄間隔區（ITS）通用引物ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）和ITS5（5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3′）（上海捷瑞生物工程有限公司合成），擴增該菌的rDNA－ITS序列。擴增產物的純化和序列測定委托北京諾賽生物科技有限公司進行，所得到的核苷酸序列與GenBank中相關序列進行同源性比較［9]。

1.3 生物學特性測定［6]

1.3.1 溫度對菌絲生長、產孢及孢子萌發的影響

將病原菌接種于PDA平板上，分別在6、12、18、24、26、28、30、35℃和40℃下培養4d，十字交叉法測量菌落直徑；培養7d后在每個培養皿中加入10mL無菌水，用毛筆將孢子刷下，紗布過濾后用血球計數器計數，計算產孢量［10]；每個處理設3次重復。

用0.5%葡萄糖液配制分生孢子懸浮液（濃度為低倍鏡下每個視野30～50個分生孢子），分別在上述不同溫度下培養12h，鏡檢300個孢子的萌發情況，孢子的萌發以芽管的長度超過孢子直徑的一半為標準（下同），統計萌發率。每個處理設3次重復。

分生孢子萌發率＝（萌發孢子總數／300）×100%。

1.3.2 pH對菌絲生長、產孢和孢子萌發的影響

將病原菌接種于pH 為3、4、5、6、7、8、9、10、11的PDA平板上，28℃下培養4d，測量菌落直徑和產孢量（方法同1.3.1）；配制孢子懸浮液（方法同1.3.1），并調成上述不同的pH，28℃下培養12h，鏡檢萌發情況。每個處理設3次重復。

1.3.3 光照處理對菌絲生長、產孢和孢子萌發的影響

將直徑為6mm的菌碟移入PDA平板，分別采用連續光照、完全黑暗和12h光暗交替3種條件，于28℃下培養，4d后測菌落直徑，7d后測產孢量。每處理重復3次。

1.4 罹病腫節風植株中異嗪皮啶含量測定［1]

1.4.1 樣品及試劑

試驗所用腫節風均采自廣西藥用植物園腫節風種質圃，將不同病情指數的腫節風編號分類后，經自然干燥，備用，不感病植株作對照。試驗所用的異嗪皮啶對照品由中國藥品生物制品檢定所提供（批號：110837－200304）；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純。

1.4.2 主要儀器

VARIAN210型高效色譜儀。

1.4.3 供試品的制備

取腫節風藥材樣品粉末（過3號篩），精密稱取1g粉末，置具橡膠塞的圓底燒瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密閉塞緊，稱定重量，加熱回流1h放冷，再稱定重量。用甲醇補足減少的重量。用微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.4.4 色譜條件

精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，參照《中國藥典》（2010）腫節風含量測定方法測定，即得。色譜條件為：色譜柱Sun－FireTM－C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相乙腈—0.1%磷酸溶液（20：80）；流速1.0mL／min；溫度30℃；檢測波長342nm。

1.4.5 標準曲線

依次吸取2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μL 標準液注入高效液相色譜儀，以進樣量（x）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標，得回歸方程：y＝129.96x－29.338，R＝0.999 9，進樣量在0.102～0.605μg范圍內線性關系良好。

1.4.6 對照品溶液的制備

稱取異嗪皮啶對照品1.97mg，加入定量甲醇稀釋，吸取定量稀釋液用10mL容量瓶定容，加入定量甲醇稀釋，配成10μg／mL的對照品溶液。

2 結果和分析

2.1 病害調查

田間癥狀主要表現在植物葉片上（圖1a）。發病初期在葉片上呈現圓形、橢圓形紅褐色小斑點，后期擴展成深褐色圓形病斑，中央則由灰褐色轉為灰白色，病斑邊緣有黃色暈圈，最后病斑轉為黑褐色，并產生輪紋狀排列的小黑點。嚴重時一個葉片上有十多個至數十個病斑，后期病斑穿孔，病斑多時融合成片導致葉片干枯。病原菌也可侵染葉柄、莖部，通常會出現圓形或近圓形的病斑，呈淡褐色，其上生有輪紋狀排列的黑色小點，后期病斑部縊縮，葉柄或莖折斷。莖部染病（圖1b），可產生與葉片上相似的癥狀，但多從葉腋處先發生，并向新生枝及主莖擴展，造成病部變褐，凹陷，病斑多為圓筒形或長橢圓形。嚴重時，病斑可以布滿莖表，并可串連成片，使莖的表皮呈黑褐色，嚴重影響養分的運輸，造成植株生長衰弱，部分病株枯死。

圖1 腫節風炭疽病癥狀

田間病情調查結果表明腫節風炭疽病在南寧周年均有發生（圖2）。1－5月及11－12月的病情指數相對較低，均小于30；5－9月份隨著溫度的升高及降水的增加，病情指數不斷升高，8、9月的病情指數達到高峰，分別為61.06和54.78。田間調查發現老葉多從4月初開始發病，5－6月迅速發展，新葉則多從8月開始發病。病菌以菌絲體、分生孢子或分生孢子盤在寄主殘體或土壤中越冬，分生孢子靠風雨、澆水等傳播。田間栽植過密、通風不良、葉子相互交叉更容易感病。

圖2 腫節風炭疽病田間周年發生情況

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 致病性測定

接種葉片在室溫下保濕培養5d后，針刺接種的葉片表現出與自然發生的葉枯病相似的癥狀（圖1c），病斑初為斑點狀，逐漸擴展成圓形或橢圓形大斑，深褐色，且由于溫濕度條件好，生長旺盛，7d后病斑迅速蔓延至葉緣，從發病葉片上再分離的病菌與原接種菌株相同，證實了原接種菌株為致病菌，傷口為該菌對寄主成功侵染的前提條件之一。以同樣的方法得到病葉柄的致病菌，經鑒定與葉片致病菌為同一菌。

2.2.2 病原菌的形態學鑒定

在PDA培養基上菌落圓形，邊緣整齊，初為淺灰白色，后轉深煙灰色至黑褐色，培養皿反面，菌落以接種點為中心，呈數圈黑褐色同心輪紋。菌絲體白色，氣生菌絲平鋪，絨毛狀，后期菌落中央形成土紅色黏稠孢子團。分生孢子盤黑褐色，褥座狀，有剛毛，頂端稍尖、黑褐色，有分隔。分生孢子新月形、單孢、無色，基部稍鈍，頂端稍尖，內含1個油球，大小為（18.5～25.8）μm× （3.0～4.2）μm，附著胞（10.2～13.6）μm×（6.8～8.6）μm，深褐色，不規則三角形。據上述特征初步鑒定該種病原菌為炭疽屬真菌（Colletotrichumsp.）。

2.2.3 病原菌的rDNA—ITS序列分析

采用通用引物ITS4／ITS5對菌株的rDNA—ITS序列進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約為600bp的片段，經序列測定，該片段全長554bp（圖3）。將上述測序結果在GenBank中進行同源性分析，該病原菌株與Colletotrichum dematium的同源性達99%。結合形態鑒定確定該病原菌為黑線炭疽菌（Colletotrichum dematium）。

圖3 菌株ITS－rDNA片段序列

2.3 菌株生物學特性

2.3.1 溫度對菌絲生長、產孢及孢子萌發的影響

黑線炭疽菌在6～35℃均能夠生長，12～35℃生長良好，適宜生長溫度為26～28℃，40℃菌絲停止生長，不產孢子。

2.3.2 pH對菌絲生長、產孢和孢子萌發的影響

表2試驗結果表明：黑線炭疽菌的菌絲體在弱酸、弱堿和中性條件下生長良好，隨著酸堿度的增加，菌絲體的生長活性逐漸降低；pH為5時產孢量最大；pH為11時產孢量最小；黑線炭疽菌在中性或近中性條件下孢子萌發率最高，隨著酸度或堿度的增加，孢子萌發率逐漸降低，在pH為7時黑線炭疽菌的孢子萌發率達最大值，pH為3時孢子萌發率均為最小值。

2.3.3 光照處理對菌絲生長、產孢和孢子萌發的影響

結果如表3所示，黑線炭疽菌菌絲生長及產孢對光均不敏感，在所有的光環境下均保持較好的長勢，差異不顯著。在黑暗環境下的孢子萌發率較低，說明光照有利于孢子萌發。

表3 光照處理對菌絲生長、產孢和孢子萌發的影響1）

2.4 罹病腫節風的藥材質量

表4結果顯示：輕微感病（病情指數＜10）的腫節風藥材，異嗪皮啶含量與健康植株含量相同，藥材質量未受影響；病情指數＞10的腫節風藥材，與健康植株相比異嗪皮啶含量均有所減少；除了病情指數為30～40范圍的腫節風藥材，其他感病藥材的異嗪皮啶含量都隨著病情的加重而降低；當病情指數增加到60～70，異嗪皮啶含量顯著低于健康植株，且在病指數達90～100，異嗪皮啶含量為0.019 6%，低于藥典要求（不得少于0.020%）。可見，病情指數范圍60～70，是異嗪皮啶含量的臨界期，大于此臨界值，對藥材質量影響較大。

表4 腫節風炭疽病不同病情指數異嗪皮啶含量及植株鮮重

隨著病情的發展，腫節風炭疽病所造成的產量損失逐漸增加。病害發生初期（病情指數＜50），病害對產量所造成的損失較小，植株鮮重減少3.04%～6.44%；病情指數50～60時，病害所造成的損失顯著增加，植株鮮重減少了34.56%，當病情指數＞90，大部分葉片及莖干均干枯，植株鮮重減少至62.32%。可見，病情指數范圍在50～60，植物鮮重為一個臨界期，大于此范圍的發病情況會對藥材產量影響較大。

綜合考慮藥材產量和質量，建議病情指數50～60，就需開始進行病害的防治工作。

3 結論與討論

炭疽病是植物常見病害，多為炭疽菌屬真菌引起［11]，現 有 文 獻 報 道 黑 線 炭 疽 菌 （Colletotrichum dematium）的寄主僅有麥冬、銀邊沿階草等植物［12－13]。腫節風是黑線炭疽菌的新記錄寄主。

黑線炭疽菌最適宜的生長溫度為26～28℃；35℃下菌絲正常生長，但不能產孢，40℃時菌絲不能生長，表明高溫可抑制孢子的形成；中性或弱酸、弱堿條件適宜該菌菌絲的生長，孢子的產生及萌發；光照對菌絲的生長、孢子的產生無明顯影響，而對孢子的萌發有一定的促進作用。以上結果與前人報道基本一致［12－13]。炭疽菌主要以分生孢子盤、菌絲、分生孢子在土壤、病殘枝上越冬，以分生孢子完成初侵染和再侵染［14]。要有效進行防治，還需以其生物學特性為基礎，結合環境因子、耕作條件等綜合因素，掌握其侵染及流行規律，從而制定包括農事特別是輪作、化學等生態調控的技術措施。

植物病害會影響藥材產量和質量［15－16]。本研究結果得出相似的結論：（1）腫節風炭疽病會造成產量損失，隨著病情的加重，植株鮮重減少。分析原因是由于病害加重，葉片枯死，從而影響了光合作用，減少了有機物的積累，使產量下降，而這種下降在病情較輕和病害發生初期并不明顯，只有到病情特別嚴重時才表現較為明顯。（2）感病腫節風的有效成分含量隨病情不同而有一定變化。病情指數＞10，有效成分含量均低于健康植株，總體上隨著病情的加重，有效成分含量逐漸減低。病情指數大于50的植株，不適宜入藥。

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