4種植物提取物對茶炭疽病菌的體外抑制作用

張 亮， 袁 爭， 朱 蔚， 高旭暉

（農業部茶葉生物化學與生物技術重點實驗室，合肥 230036）

茶炭疽病是常見的茶樹葉部病害之一，在我國各產茶區均有發生，山區茶園尤為普遍，除茶樹外，還危害山茶、油茶等植物［1]。茶炭疽病主要危害當年生成葉，大流行時可致茶樹樹勢衰落，大量落葉，產量降低［2]。生產上人們往往使用見效快的化學農藥來防治此病，但由于長期施用化學農藥導致的農藥殘留問題、抗藥性問題愈加突出，與當下大力倡導的有機茶生產形勢相悖。生物農藥的活性成分是自然界存在的物質，有順暢的降解途徑，這些成分易分解、安全間隔期短，對作物不產生藥害［3]，生物農藥在茶樹病蟲防治方面已有了應用，如茶樹內生菌對茶樹病害的控制作用［4]，而植物源藥劑尚無報道。本文研究了4種植物的丙酮提取物對茶炭疽病菌的抑制作用，旨在為茶樹病害的無公害防治開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物及溶劑

側柏（Platycladus orientalis）葉、香樟（Cinnamomum camphora）葉、艾蒿（Artemisia argyi）（均采自安徽農業大學校內）、蘆柑（Citrus madurensis）（周谷堆農貿市場購買）；丙酮（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.1.2 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）；水瓊脂培養基。

1.1.3 供試病原菌

從安徽農業大學教學科研示范基地采取茶炭疽病葉，分離，經顯微觀察鑒定證實為茶炭疽病菌，單孢分離純培養獲得。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取物的制備

將側柏葉、香樟葉、蘆柑皮、艾蒿莖葉洗凈，置于恒溫箱中50℃烘干至恒重，中藥粉碎機粉碎（50～200目），密封保存。分別稱取適量各干粉于丙酮中，在40℃恒溫氣浴振蕩器中提取5h后經抽濾獲得提取液。采用旋轉濃縮的方法將提取液濃縮至膏狀，真空干燥以除去殘余的丙酮，稱重，用丙酮定容，獲得相應濃度的提取物。

1.2.2 對炭疽菌菌絲生長的抑制

采用菌絲生長速率法［5]測定不同濃度的提取物的抑菌活性。將各提取物分別配成15 000、10 000、7 500、5 000、1 000μg／mL的濃度，在無菌條件下，向50mL已滅菌的燒杯中加入3mL各濃度的提取物，再加入27mL融化了的冷卻至50℃左右的PDA培養基，充分搖勻后倒入培養皿中制成平板，每板10mL，3次重復。此時的濃度為原濃度的1／10。以等量的丙酮和培養基作對照。參照江茂生的方法［6]，將培養基放置在通風櫥中3d，以揮發去除溶劑丙酮，接入長勢一致的6mm菌餅，于25℃培養箱中培養。定時觀察菌絲生長情況，分別在48、72、96、120h用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。用DPS軟件進行差異顯著性分析。采用96h的菌絲生長抑制率作為計算有效中濃度EC50的數據。以濃度對數為自變量（x），以抑制率幾率值為因變量（y）計算提取物的毒力回歸曲線和EC50。

1.2.3 對分生孢子萌發的抑制

采用水瓊脂培養法［5]測定提取物對孢子萌發的抑制作用。選取培養7d菌株的PDA平板，在平板中加入適量無菌水，晃動，過濾，即獲得孢子懸浮液。將孢子懸浮液配成1×105個／mL的濃度。提取物的濃度配制及平板的制作程序與1.2.2方法相同。將孢子懸浮液滴入處理好的含提取物的水瓊脂平板中，并在培養皿背面畫圈標記滴入點位置以便觀察，每板3點，每點20μL，即3次重復。將各處理置于25℃培養箱中培養，待對照組90%以上萌發時觀察并計算孢子萌發率。觀察前，先將各處理放入4℃冰箱中，以阻止孢子繼續萌發。顯微鏡觀察孢子萌發情況，以每視野下能觀察到的80～100個孢子為記錄對象。

2 結果與分析

2.1 對菌絲生長的抑制作用

結果表明：1 500μg／mL濃度下，各提取物對菌絲的生長都有較好的抑制作用。其中蘆柑皮提取物的抑制效果最好，48h抑制率達100%，余者依次是艾蒿、香樟葉和側柏葉。各提取物抑制率隨著時間的延長有下降的趨勢。蘆柑皮、艾蒿、香樟葉和側柏葉96h的抑制率分別為93.32%、61.10%、55.64%和48.20%（表1，圖1）。

表1 1 500μg／mL濃度提取物對茶樹炭疽病菌菌絲的抑制作用1）

圖1 1 500μg／mL不同植物提取物對茶樹炭疽病菌菌絲96h抑制效果

通過對菌絲形態觀察，1 500μg／mL濃度的蘆柑皮、艾蒿處理的菌株48、72h皆出現大量氣生菌絲。蘆柑皮1 500μg／mL濃度處理的菌株，菌絲48h未能擴展，完全被抑制，之后擴展的菌落邊緣不圓整，略呈鋸齒狀，且各濃度都出現不圓整狀況，120h時100μg／mL濃度的得以恢復，高濃度的尚未能恢復，艾蒿、香樟葉和側柏葉均不見此種狀況。

通過Excel軟件計算了提取物的毒力回歸曲線及EC50（表2）。蘆柑皮、艾蒿、香樟葉和側柏葉各提取物的EC50分別為8.981、839.575、1 058.682μg／mL 和1 429.094μg／mL。側柏的毒力曲線斜率最大，說明在所設的濃度梯度范圍內，濃度的變化對菌絲的影響最大。蘆柑皮的斜率最小，香樟葉與艾蒿的斜率相當。

表2 植物提取物對茶炭疽病菌菌絲生長的抑制作用

2.2 對分生孢子萌發的抑制作用

1 500μg／mL濃度蘆柑皮、艾蒿、香樟葉和側柏葉對孢子萌發的抑制率分別為34.85%、85.54%、55.40%和59.68%（圖2）。除蘆柑皮外，其余提取物均表現出較好的抑制萌發作用。提取物毒力曲線及EC50如表3所示。蘆柑皮、艾蒿、香樟葉和側柏葉對孢子萌發的 EC50分別為5 764.142、281.121、1 502.49μg／mL和969.369μg／mL。

圖2 植物提取物對茶炭疽病菌分生孢子萌發的抑制率

表3 植物提取物對茶炭疽病菌分生孢子萌發的抑制作用

3 結論與討論

4種植物的丙酮提取物對茶炭疽病菌菌絲均有很好的抑制作用，其中蘆柑皮抑菌效果顯著。艾蒿對菌絲抑制效果相對香樟葉和側柏葉雖無顯著差異，但對孢子萌發的抑制顯著。江茂生等2007年報道艾蒿乙醇提取物對多種病原菌有較好的抑制作用［6]，可見艾蒿的抑菌作用具有一定的廣譜性。蘆柑皮對茶炭疽病菌絲生長的抑制作用顯著，而對孢子萌發的抑制率遠遠低于另外3種提取物，這可能是因為其中的活性物質抑菌機理不同。文獻鮮有對蘆柑皮防治植物病原菌的報道，肖琳等2010年報道柚皮乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分對蘋果腐爛病菌、辣椒炭疽菌和棉花枯萎菌等植物病原菌有較高的抑制作用［7]，并將其活性成分推測為黃酮類化合物。蘆柑皮丙酮提取物對菌絲的EC50達8.981μg／mL，其EC50更是優于肖琳等對柚皮的報道，這可能也是與蘆柑皮中富含黃酮類化合物［8]有關，因為黃酮類化合物具有廣譜的抗菌作用［9]。本試驗中蘆柑皮毒力曲線的線性不好，可能是提取物成分復雜，活性成分多樣化，蘆柑皮中的黃酮類化合物和其他活性成分協同作用造成的，其抑菌活性成分還需分離純化逐一探明。進一步研究蘆柑皮、艾蒿丙酮提取物中的活性物質對于植物源殺菌劑的開發具有潛在的應用前景。

［1]譚濟才，葉恭銀，高旭暉，等.茶樹病蟲防治學［M].北京：中國農業出版社，2002：227－229.

［2]謝寶林.茶炭疽病的識別與防治［J].農技服務，2007，24（2）：63.

［3]張志祥，程東美，徐漢虹.生物農藥的發展優勢及存在問題［J].世界農藥，2004（4）：5－10.

［4]陳百文，劉偉，趙恬歡，等.對茶樹炭疽病菌具拮抗作用的茶樹內生細菌的篩選［J].福建農林大學學報（自然科學版），2010，39（4）：341－346.

［5]方中達.植病研究方法［M].北京：中國農業出版社，1999.

［6]江茂生，許文耀.艾蒿提取物對13種植物病原菌物的抑制作用［J].福建農林大學學報（自然科學版），2007，36（4）：352－356.

［7]肖琳，金玉蘭.柚皮提取物對植物病原真菌的抑菌活性測定［J].青島農業大學學報（自然科學版），2010，27（2）：172－175.

［8]焦士蓉，王玲，林玲.蘆柑皮黃酮類物質的微波輔助提取及其抗氧化活性研究［J].西華大學學報（自然科學版），2007，26（4）：36－38.

［9]李葉，唐浩國，劉建學.黃酮類化合物的抑菌作用的研究進展［J].農產品加工（學刊），2008（12）：53－55.