津黑兩地大白菜褐腐病病原菌鑒定及生物學特性的比較

苗國輝， 聞鳳英， 張耀偉＊

（1.東北農業大學園藝學院，哈爾濱 150030；2.天津市農業科學院科潤蔬菜研究所，天津 300384）

大白菜［Brassica campestris L.ssp.pekinensis（Lour.）Olsson]是我國廣泛種植的蔬菜。褐腐病是大白菜生產中近幾年逐漸發展起來的病害，在武漢、天津、哈爾濱等地呈現出蔓延的趨勢，并被誤認為細菌性軟腐病。大白菜褐腐病主要危害大白菜的葉柄，導致葉柄腐爛，使大白菜品質降低，產量下降，其區別于細菌性軟腐病的特征是腐爛斑為褐色，無臭味。大白菜褐腐病致病菌為Rhizoctonia solani Kühn［1]。劉志恒［2]等對遼寧地區白菜葉腐病進行鑒定，確定白菜葉腐病的病原菌是立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）。何蘇琴等［3]通過對辣椒莖腐和根腐病的病組織進行分離鑒定，發現辣椒莖腐和根腐病的致病菌是立枯絲核菌。立枯絲核菌是一類廣泛存在于自然界中、并能引起多種作物病害的土壤習居真菌，到目前為止，立枯絲核菌共劃分為14個融合群、21個融合亞群［4]，Yang G H 等［5]確定甘藍葉腐病的病原菌是立枯絲核菌AG－4融合群；段春芳［6]等對云南地區的白菜、薄荷、萵苣葉腐病進行鑒定，確定引起白菜、薄荷、萵苣葉腐病的病原菌是立枯絲核菌的AG－1IB亞群。Kuramae等［7]從巴西萵苣上分離的立枯絲核菌被鑒定屬于AG1－IA亞群；從花莖甘藍、菠菜、甜瓜、番茄4種作物上分離的立枯絲核菌被鑒定屬于AG－4融合群。肖勇等［8]通過對四川省水稻立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）進行鑒定，分離得到55株立枯絲核菌，確定除D42菌株外，其余均屬于AG－1IA群；郭慶元等［9]研究發現立枯絲核菌的 AG－1、AG－2、AG－4也可危害豆類作物。

本試驗通過對天津、黑龍江兩省市大白菜褐腐病進行田間癥狀觀察、病原菌的形態學鑒定及分子鑒定，確定兩地大白菜褐腐病的病原菌，并對兩地區的病原菌進行生物學特性的比較分析。

1 材料與方法

1.1 田間癥狀調查與取樣

對天津市農業科學院科潤蔬菜試驗站和哈爾濱市東北農業大學實驗實習基地的大白菜褐腐病癥狀進行田間觀察，并取樣。

1.2 病原菌鑒定

1.2.1 病原菌的分離和純化

將上述采集的病組織用水瓊脂法分離［10]，病原菌經分離純化后保存于PDA斜面培養基上，置于4℃冰箱儲存備用。

1.2.2 病原菌形態學鑒定

將供試菌株接種于PDA平板上，25℃恒溫黑暗培養3d后，對其菌落形態進行觀察。12d后觀察是否產生菌核。菌絲形態觀察采用鄧振山［11]、許志剛的方法［12]。

1.2.3 病原菌致病性測定

采用苗期離體葉片法對分離的菌株進行致病性測定。在接種時取完整的幼嫩葉片，洗凈后置于鋪有無菌吸水紙的鐵盤中，并在鐵盤中加入少許無菌水以保持濕度。將菌株在PDA上進行擴繁，在25℃恒溫黑暗條件下培養3d，用直徑為6mm的打孔器在活化好的菌落邊緣打取菌絲塊，用無菌接種針將菌絲塊接種于葉柄上，每個菌株接種20個葉片，以瓊脂塊接種的葉片作為對照。

1.2.4 病原菌分子鑒定

病原菌DNA提取采用Sun的方法［13]。用真菌的ITS序列通用引物ITS1和ITS4［14]對病原菌的ITS序列進行PCR擴增，PCR反應體系總體積為50μL，反應液組分為：10×Buffer（含 mg2＋）5μL，10mmol／L dNTP 4μL，5U／μLTap酶0.5μL，模板DNA1.0μL，用ddH2O使總體積達到50μL。PCR反應程序為：95℃預變性3min；94℃變性1min；55℃退火1min，72℃延伸1min，共30個循環；最后72℃延伸10min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，克隆至pEASY－T3克隆載體上，再轉化至大腸桿菌感受態細胞中（兩者均由全式金公司提供），在含IPTG、X－gal、氨芐青霉素的LB平板上進行藍白斑法篩選，PCR檢測后送北京華大生物工程技術服務有限公司測序。測序結果在GenBank數據庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）中進行BLAST比對分析，并從GenBank中下載23個菌株的相關ITS序列，用DNAStar軟件Meglign程序構建系統進化樹。

1.2.5 病原菌融合群鑒定

融合群鑒定標準菌株由華中農業大學周而勛教授提供，采用陳延熙等改進的玻片配對法［15]，將已分離鑒定出的立枯絲核菌TJ、DB兩菌株分別與AG1～AG8及AG－BI標準測試菌株配對培養進行融合群鑒定。

1.3 津黑兩地病原菌生物學特性比較

1.3.1 不同碳源對菌絲生長、菌核形成的影響

基本培養基為查氏培養基［16]，以其蔗糖含碳量42.07%為標準，碳源用等質量含碳量的葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、可溶性淀粉代替。供試菌株在PDA平板上25℃恒溫黑暗培養3d，在無菌條件下沿菌落邊緣打取直徑6mm的菌絲塊接種到不同碳源的查氏培養基上，25℃恒溫黑暗條件下培養。3d后測其菌落直徑，12d后測定氣生菌核干重。3次重復。

1.3.2 不同氮源對菌絲生長、菌核形成的影響

基本培養基為查氏培養基［16]，以其硝酸鈉含氮量16.47%為標準，氮源用等質量含氮量的硝酸鉀、蛋白胨、硝酸銨、甘氨酸、硫酸銨5種氮源代替。供試菌株在PDA平板上25℃恒溫黑暗培養3d，在無菌條件下沿菌落邊緣打取直徑6mm的菌絲塊，接種到含不同氮源的查氏培養基上，置于25℃恒溫黑暗條件下培養。3d后測其菌落直徑，12d后測定氣生菌核干重。3次重復。

1.3.3 不同溫度對菌絲生長、菌核形成的影響

供試菌株在PDA平板培養基上25℃恒溫黑暗培養3d，在無菌條件下沿菌落邊緣打取直徑6mm的菌絲塊移植到PSA培養基平板中央，置于21、23、25、27、29℃不同溫度下恒溫黑暗培養。3d后測定菌落直徑，12d后測定氣生菌核干重。3次重復。

1.3.4 不同pH對菌絲生長、菌核形成的影響

供試菌株在PDA平板培養基上25℃恒溫黑暗培養3d，在無菌條件下沿菌落邊緣打取直徑6mm的菌絲塊移植到pH 分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的PSA培養基平板中央。于25℃恒溫黑暗條件下培養。3d后測定菌落直徑，12d后測定氣生菌核干重。3次重復。

1.3.5 不同光照條件對菌絲生長、菌核形成的影響

供試菌株在PDA平板培養基上25℃恒溫黑暗培養3d，在無菌條件下沿菌落邊緣打取直徑6mm的菌絲塊移植于PSA培養基平板中央，于25℃恒溫培養。光照分別為24h光照、12h光照、全黑暗。3d后測定菌落直徑，12d后測定氣生菌核干重。3次重復。

1.3.6 菌絲、菌核致死溫度測定

菌絲致死溫度測定：用水浴鍋設定40、42、44、46、48、50℃，將裝有無菌水的試管在水浴鍋里升至與水浴鍋的水相同溫度。供試菌株在PDA平板培養基上25℃恒溫黑暗培養3d，在無菌條件下從邊緣打取直徑6mm的菌絲塊移植于裝有無菌水的試管里，在不同溫度下處理10min后，移植于PSA平板上，3d后觀察其菌絲生長狀況。3次重復。

菌核致死溫度測定：供試菌株在PDA平板培養基上25℃恒溫黑暗培養12d后選取大小一致的菌核，將菌核移植于裝有無菌水的試管里，在不同溫度下處理10min后，在無菌環境下將菌核移植于PSA平板上，5d后觀察菌核萌發狀況。3次重復。

2 結果與分析

2.1 大白菜褐腐病癥狀

大白菜褐腐病主要危害大白菜葉柄；病害初期從葉柄基部發病，病斑大小為1～4cm，病斑淺黃色且中間著生小黑點，以后逐漸擴大凹陷成褐色至深褐色大斑，有時病斑表面呈現隱約的輪紋，濕度大時病斑上密生灰白色菌絲，逐漸聚集成團，并形成褐色菌核；后期葉柄腐爛（圖1a、b）。

圖1 大白菜褐腐病癥狀

2.2 大白菜褐腐病病原菌分離

2.2.1 病原菌形態特征

菌絲初期白色，絨毛狀，有隔，近分支處有縊縮，分支初期成直角，后漸近銳角（圖2a）。生長后期，天津地區分離的TJ菌株的菌絲由白色變為褐色乃至深褐色（圖2b），黑龍江地區分離的DB菌株的菌絲由白色變為淡褐色（圖2c），并在生長后期均形成菌核（圖2d）。

圖2 立枯絲核菌菌絲及菌落形態特征

2.2.2 致病性測定結果

將分離到的病菌菌絲塊接種到大白菜葉柄上，結果表明，葉柄接種2d后，出現黑褐色腐爛病斑，接種5d（圖1c、d）后，病斑擴大至整個葉柄，且葉柄腐爛。接種發病率為100%，且癥狀與田間發病癥狀相同。對照葉片未發病。對發病葉片進行再分離，可分離到與接種菌株形態一致的病原菌。說明該菌為致病菌株。

2.2.3 大白菜褐腐病分離菌株的分子鑒定

用引物ITS1和ITS4擴增了兩個菌株的核糖體基因ITS序列，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。結果顯示，分離菌株的核糖體基因ITS序列全長為650bp左右，這與預期片段長度一致。經北京華大基因公司對PCR產物測序，確定兩菌株的ITS序列全長均為663bp。將兩菌株的序列與GenBank數據庫中相關的立枯絲核菌菌株的基因序列進行比對分析，結果表明TJ菌株ITS序列與Rhizoctonia solani isolate（JF817349.1、AY241 672.1、AY154 317.1，AB054 852.1、DQ279 002.1、EF532 828.1）相似性為100%，DB菌株序列與Rhizoctonia solani isolate（EU－591 761.1、DQ356 412.1、AF354 063.1、FJ435 141.1）相似性最高為99%。

將兩個菌株與GenBank數據庫中立枯絲核菌5.8S rDNA－ITS序列比對，構建系統進化樹。從系統進化樹（圖3）可以看出，從大白菜褐腐病組織上分離的TJ菌株與Rhizoctonia solani isolate JF817 349列在同一組，表明它們之間差異不明顯，親緣關系近。而DB菌株獨立于其他立枯絲核菌菌株，表明DB菌株與其他已分離的立枯絲核菌菌株不同，為一株新的立枯絲核菌菌株，GenBank登錄號JN412 624。

圖3 基于5.8SrDNA－ITS核苷酸序列構建的系統進化樹

2.2.4 病原菌融合群鑒定

融合群鑒定表明，天津地區分離的TJ菌株與AG－2－1融合群融合，而與AG－1－IA等其他9個菌株不融合；黑龍江地區分離的DB菌株與AG－1融合，而與AG－2等其他9個菌株不融合（表1）。因此確定TJ菌株屬于AG－2融合群，DB菌株屬于AG－1融合群。

表1 TJ、DB兩菌株的融合群鑒定1）

2.3 津黑兩地菌株的生物學特性比較

2.3.1 不同碳源對菌絲、菌核生長的影響比較

由圖4a①可知，不同碳源對兩菌株菌絲生長具有明顯的影響。兩菌株利用碳源相同點均是在以淀粉為碳源的查氏培養基上生長最快，在果糖上生長最慢，且與其他碳源呈顯著差異；不同點是以可溶性淀粉、葡萄糖為碳源時，DB菌株生長速率較快，以果糖為碳源時，TJ菌株生長速率較快。

由圖4a②可知，兩菌株在不同碳源查氏培養基上生長時，其菌核形成有明顯的差異。相同點是兩菌株在以可溶性淀粉為碳源生長時最先形成氣生菌核，且兩菌株在以蔗糖為碳源時形成的氣生菌核量均是最多，且與其他碳源呈顯著性差異。葡萄糖和可溶性淀粉次之，以乳糖和果糖為碳源時形成的氣生菌核量最少。半埋式菌核形成量均是蔗糖最多，葡萄糖和可溶性淀粉次之。兩菌株菌核形成差異是，TJ菌株在以乳糖和果糖為碳源的查氏培養基上生長時均生成半埋式菌核；DB菌株在以乳糖和果糖為碳源的查氏培養基上生長時未見半埋式菌核。并且TJ菌株在不同碳源的查氏培養基上生長時菌核形成量均快于并且多于DB菌株。

圖4 TJ和DB菌株生物學特性比較

2.3.2 不同氮源對菌絲、菌核生長的影響比較

由圖4b①可知，不同氮源對兩菌株生長具有明顯影響。兩菌株利用氮源相同點是在以蛋白胨為氮源時生長最快，在以甘氨酸為氮源時生長最慢，且菌絲在兩氮源上的生長呈顯著性差異。兩菌株在氮源不同的查式培養基上生長時均是DB菌株生長速率快于TJ菌株。

由圖4b②可知，在不同氮源查式培養基上生長時，兩菌株菌核形成的相同點是，兩菌株均在以硝酸銨和硫酸銨為氮源時最先形成氣生菌核，氣生菌核量均是硫酸銨最多，且均以甘氨酸為氮源時形成氣生菌核量最少，并且兩氮源之間呈顯著性差異。兩菌株菌核形成差異是，TJ菌株在以硝酸鉀為氮源時最先形成半埋式菌核，且形成半埋式菌核量最多，與其他氮源呈顯著性差異；DB菌株在以硝酸銨為氮源時最先形成半埋式菌核，且形成半埋式菌核最多；在不同氮源上生長時TJ菌株與DB菌株相比菌核形成速度快且形成量大。

2.3.3 不同溫度對菌絲、菌核生長的影響比較

由圖4c①可知，兩菌株均在25℃時生長最快且菌絲層最厚，21～25℃菌絲生長差異不顯著，29℃時菌絲均生長最慢且菌絲層最薄，25℃和29℃條件下菌絲生長呈顯著性差異。并且在不同溫度下生長速度DB菌株普遍快于TJ菌株，DB菌株菌絲層厚度大于TJ菌株，氣生菌絲多于TJ菌株。

由圖4c②可知，在不同溫度下生長時，兩菌株形成菌核的相同點是，均在25℃時氣生菌核和半埋式菌核量最多。兩菌株不同點是，TJ菌株半埋式菌核量及氣生菌核量在29℃時均是最少，而DB菌株則是在21℃時半埋式菌核量最少，氣生菌核量則是29℃時最少；兩種菌株在不同溫度下生長時菌核形成速度及形成量均是TJ菌株快于并且大于DB菌株。

2.3.4 不同pH對菌絲、菌核生長的影響比較

由圖4d①可以看出，不同pH對兩菌株的菌絲生長影響也有明顯影響。兩菌株在pH7時生長均是最快且菌絲層最厚，pH9時均是生長最慢且菌絲層最薄且兩者之間呈顯著性差異，pH5～7菌絲生長差異不明顯。在不同pH條件下DB菌株的菌絲生長速度快于TJ菌株。

由圖4d②可知，兩種菌株均在pH7時氣生菌核和半埋式菌核量最多，pH5時氣生菌核量均是最少，且pH5和pH7的菌核量呈顯著性差異，不同的是TJ菌株的菌核量多于DB菌株，并先于DB菌株形成菌核。

2.3.5 不同光照對菌絲、菌核生長的影響比較

由圖4e①可知，兩菌株均是在12h光照時菌絲生長最快且菌絲層最厚，而在全黑暗時菌絲生長最慢且菌絲層最薄。并且在不同光照條件下菌株生長速度DB菌株普遍快于TJ菌株。

由圖4e②可知，兩種菌株均是在12h光照時氣生菌核和半埋式菌核量最多，全黑暗時氣生菌核和半埋式菌核量最少。不同的是TJ菌株的菌核量多于DB菌株，并先于DB菌株形成菌核。

2.3.6 致死溫度比較

由表2可知兩菌株相同點是在低于40℃下均能存活，而在42℃以上時菌絲均不能生長。兩菌株的不同點是菌核致死溫度TJ菌株為46℃，而DB菌株則為48℃。

表2 TJ、DB兩菌株菌絲、菌核致死溫度的比較

3 結論與討論

通過對天津和黑龍江兩個地區的大白菜褐腐病病原菌常規分離鑒定、分子鑒定，確定導致兩地區大白菜褐腐病的致病菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn），通過融合群鑒定及5.8SrDNA－ITS序列系統進化樹分析確定兩菌株分別屬于AG－2和AG－1兩個融合群，并且DB菌株為一個新菌株，GenBank登錄號JN412 624。

不同培養條件對菌絲生長影響的測定結果表明，TJ、DB兩菌株生長最適pH為7，與劉志恒等研究結果相似［1，18]；兩菌株均是在以可溶性淀粉和蛋白胨為碳源和氮源的培養基上生長時菌絲生長最快，這與林清等人研究結果相似［17]，而劉志恒等人從番茄莖基腐病分離的立枯絲核菌，最適氮源為硝酸鈉［18]。試驗確定TJ、DB兩菌株的最適生長溫度為25℃，在12h光照時菌絲生長最快且菌絲層最厚，這與劉志恒結果不一致，其研究發現黑暗條件有利于白菜絲核菌葉腐病病原菌（Rhizoctonia solani Kühn）菌絲生長，而全光照與12h光暗交替條件下菌絲生長緩慢［2]；同時劉志恒認為導致番茄莖基腐病的立枯絲核菌最適溫度為20℃［18]。在菌核形成方面，TJ、DB菌株均是在pH7時、以可溶性淀粉為碳源的培養基上生長時最先形成氣生菌核，這與劉志恒等研究結果相似［2]。兩菌株在氮源、溫度對菌核形成影響上與劉志恒等結果有所差異［2，18]；兩菌株均在12h光照條件下氣生菌核和半埋式菌核形成量最多，全黑暗條件下最少，而劉志恒等認為光照對白菜絲核菌葉腐病病原菌（Rhizoctonia solani Kühn）菌核形成量無關［2]。同時張麗等認為甘藍立枯絲核菌球腐病病原菌在連續光照下有利于菌核形成［4]。據此認為，寄主來源不同的立枯絲核菌由于其各自發生環境不同或是菌群分化等的影響，致使病原菌某些生物學特性存在一定差異。

本試驗測定致死溫度時，先將試管溫度升至設定的溫度，確定兩菌株的菌絲致死溫度均為42℃，菌核致死溫度則分別為TJ菌株46℃，DB菌株48℃；而劉志恒等認為從番茄莖基腐病分離的立枯絲核菌菌絲致死溫度為50℃，菌核致死溫度為59℃［18]；張麗等人認為包菜立枯絲核菌球腐病病原菌菌絲致死溫度為45℃，菌核致死溫度為50℃［4]。這些差異還需進一步研究驗證。

在不同碳源、氮源、溫度、pH下，DB菌株菌絲生長速度快于TJ菌株，但TJ菌株先于DB菌株形成菌核，并且菌核量多于DB菌株，說明兩個菌株在生長發育過程中存在明顯差異，形成了與兩地生態環境相適應的無性繁殖過程。同時發現在不同碳源、氮源、溫度、pH下，兩菌株菌核形成存在明顯差異，如TJ菌株在以硝酸鉀為氮源的培養基上形成半埋式菌核量最多；DB菌株以硝酸銨為氮源的培養基上形成半埋式菌核最多，這可能與兩菌株分屬于不同融合群、具有不同生態適應性有關。

［1]呂佩珂，李明遠，吳鉅文，等.中國蔬菜病蟲害原色圖譜［M].第2版.北京：農業出版社，1998.

［2]劉志恒，李艷君.白菜絲核菌葉腐病病原菌鑒定及生物學特性研究［J].北方園藝，2009（5）：57－60.

［3]何蘇琴.引起辣椒莖腐和根腐的立枯絲核菌的生物學特性及致病性研究［J].甘肅農業科技，2002（9）：44－45.

［4]張麗.包菜立枯絲核菌球腐病的病原學研究［D].武漢：華中農業大學植物科技學院，2008.

［5]Yang G H，C hen X Q.First report of foliar blight in Brassica rapassp.chinensis caused by Rhizoctonia solani AG－4［J].Plant Pathology，2004，53：260.

［6]段春芳，楊根華.立枯絲核菌AG－1IB引起白菜、薄荷、萵苣葉腐病的研究［J].云南農業大學學報，2008，23（3）：422－425.

［7]Kuramae E E ，Buzeto A L，Ciampi M B，et al.Identification of Rhizoctonia solani AG 1－IB in lettuce，AG4HG－I in tomato and melon，and AG－4HG－III in broccoli and spinach in Brazil［J].European Journal of Plant Pathology［J].2003，109（4）：391－395.

［8]肖勇，劉明偉，李剛，等.四川省水稻立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）的遺傳分化與致病力［J].中國水稻科學，2008，22（1）：87－92.

［9]郭慶元，楊金紅，季良.新疆6種豆科作物立枯絲核菌菌絲融合群研究［J].新疆農業科學，2005，42（6）：382－385.

［10]周而勛，楊媚.從植物病組織中分離立枯絲核菌的快速、簡便技術［J].華南農業大學學報，1998，19（1）：125－126.

［11]鄧振山，張寶成，孫志宏，等.立枯絲核菌營養菌絲多型性觀察［J].微生物學雜志，2005，6（25）：56－58.

［12]許志剛.普通植物病理學［M].第4版.北京：高等教育出版社，2009.

［13]Sun Y，Zhang W，Li F L，et al.Identification and genetic mapping of novel genes that regulate leaf development in Arabidopsis［J].Cell Research，2000，10（4）：325－335.

［14]White T J，Bruns T，Lee S.Analysis of phytogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes［M]∥Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al.PCR protocols：A guide to methods and applications.New York：Academic，1990：15－22.

［15]陳延熙.關于Rhizoctonia solani菌絲融合群分類和有性世代的研究［J].植物病理學報，1985，3（1）：139－143.

［16]方中達.植病研究方法［M].第3版.北京：農業出版社，1998：50.

［17]林清，陶家鳳.立枯絲核菌對碳、氮營養的需求［J].四川農業大學學報，1992，10（3）：484－490.

［18]劉志恒，馬家瑞，楊紅，等.番茄莖基腐病病原菌的生物學特性［J].植物保護，2010，36（2）：94－97.