海洋放線(xiàn)菌M1D14代謝產(chǎn)物對(duì)幾種重要植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的抑制作用

田 陽(yáng)， 李 平， 張 莉， 孫建華＊， 高丙利

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市細(xì)胞遺傳與分子調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；2.浙江東奇生物科技有限公司，湖州 313000）

植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的分布非常廣泛，其種類(lèi)已達(dá)200多屬5 000多種，每一種植物至少被一種線(xiàn)蟲(chóng)寄生［1]。植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害嚴(yán)重，全世界每年因線(xiàn)蟲(chóng)危害給糧食和纖維作物造成的損失約為12.7%，對(duì)蔬菜、花生、煙草和果樹(shù)造成的損失超過(guò)20%，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)780億美元［2]。根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)和松材線(xiàn)蟲(chóng)是農(nóng)林生產(chǎn)中危害十分嚴(yán)重的植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)，目前已成為農(nóng)林生產(chǎn)上的重要病原物［3]，其中根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)感染一般可造成作物產(chǎn)量損失10%～20%，高的達(dá)70%以上［4]。近年來(lái)，利用生物防治技術(shù)控制線(xiàn)蟲(chóng)病害成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)。生防微生物的應(yīng)用是防治植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)病的重要手段，是保護(hù)生態(tài)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有力保證［5－7]。

在線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治中，抗生素的應(yīng)用是較為有效的防治途徑之一。放線(xiàn)菌是抗生素的重要來(lái)源之一，其在自然界中廣泛分布于各種不同的自然生態(tài)環(huán)境里，種類(lèi)繁多、代謝功能各異，是一類(lèi)有著廣泛實(shí)際用途的生物資源［6]。1993年美國(guó)Willian Fenical［8]首先提出海洋微生物是一個(gè)新的化學(xué)研究資源，將成為新的研究熱點(diǎn)。海洋放線(xiàn)菌產(chǎn)生的抗生素，不僅結(jié)構(gòu)新穎而且活性代謝產(chǎn)物也是最多的，其中90%以上的海洋放線(xiàn)菌活性產(chǎn)物來(lái)自于鏈霉菌屬，僅有少量的來(lái)自于放線(xiàn)菌的其他菌屬［9]。利用海洋放線(xiàn)菌的代謝產(chǎn)物控制線(xiàn)蟲(chóng)病害成為防治植物線(xiàn)蟲(chóng)病的重要發(fā)展方向［10]。目前有很多利用海洋真菌代謝產(chǎn)物殺線(xiàn)的報(bào)道，但殺線(xiàn)蟲(chóng)種類(lèi)單一［11]。利用海洋放線(xiàn)菌代謝產(chǎn)物防治線(xiàn)蟲(chóng)的報(bào)道不多，本研究是利用海洋放線(xiàn)菌代謝產(chǎn)物對(duì)多種植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行研究，對(duì)于有效利用海洋放線(xiàn)菌具有一定的意義。

海洋放線(xiàn)菌M1D14是課題組篩選出的具有較高殺線(xiàn)蟲(chóng)活性的生防菌株。本試驗(yàn)著重對(duì)其進(jìn)行殺線(xiàn)蟲(chóng)譜研究并初步對(duì)其殺線(xiàn)蟲(chóng)機(jī)理進(jìn)行探索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

海洋放線(xiàn)菌M1D14菌株由浙江東奇生物科技有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）察 氏 培 養(yǎng) 基 標(biāo) 準(zhǔn) 配 置 為 NaNO32g／L，K2HPO41g／L，MgSO4·7H2O 0.5g／L，KCl 0.5g／L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g／L，瓊脂15g／L，葡萄糖36g／L。

（2）YE培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)配置為酵母膏4g／L，麥芽精10g／L，葡萄糖4g／L，瓊脂3g／L。

（3）M8培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)配置為可溶性淀粉20g／L，葡萄糖10g／L，酵母膏2g／L，酪蛋白水解物4g／L，牛肉膏2g／L，CaCO33g／L。

1.1.3 供試線(xiàn)蟲(chóng)

（1）松材線(xiàn)蟲(chóng)（Bursaphelenchus xylophilus），由天津師范大學(xué)提供。

（2）南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）2齡幼蟲(chóng)，由浙江東奇生物科技有限公司提供。

（3）大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)（Heterodera glycines）2齡幼蟲(chóng)，由浙江東奇生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海洋放線(xiàn)菌菌株的獲得及發(fā)酵液制備

（1）海洋放線(xiàn)菌菌株M1D14的純化：將保藏的菌種畫(huà)線(xiàn)轉(zhuǎn)接至平板上，28℃，培養(yǎng)5～7d。

（2）海洋放線(xiàn)菌菌株M1D14的種子培養(yǎng)：挑取純化菌株至YE種子培養(yǎng)液中，28℃，200r／min，振蕩培養(yǎng)3d。

（3）海洋放線(xiàn)菌菌株M1D14的發(fā)酵培養(yǎng)：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將種子液按1∶10比例轉(zhuǎn)接至M8培養(yǎng)液中，28℃，200r／min，振蕩培養(yǎng)7d。將發(fā)酵液用甲醇萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，放入－10℃冰箱保存。

1.2.2 南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵懸液的制備

采用改良的振蕩法分離法［12－13]。取溫室里接種南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)60d后的番茄的根，將根剪成1～2cm的小段；放于200mL 1%的次氯酸鈉溶液中，在豆?jié){機(jī)中攪拌剪切1～4min；將懸浮液快速經(jīng)100目、300目和500目的網(wǎng)篩，上下振蕩網(wǎng)篩，在500目的網(wǎng)篩上即可收集到游離的卵；隨即快速用無(wú)菌水沖洗500目篩網(wǎng)上的卵，以除去殘留的次氯酸鈉；再次沖洗振蕩根段以獲取更多的卵，用過(guò)篩法收集到離心管中，在底部加入40%蔗糖溶液20mL梯度離心，3 500r／min，5min，吸取界面溶液過(guò)500目篩，用水沖洗篩子去除蔗糖，反向?qū)⒙褯_入三角瓶中。加水制成卵懸液，置于4℃冰箱中備用。

1.2.3 供試線(xiàn)蟲(chóng)的制備

（1）南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)（J2）的制備：將上述南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵懸液置于自制孵化器中，加無(wú)菌水放置在25～28℃環(huán)境條件下孵化；4d左右會(huì)孵出大量的J2，收集到滅菌三角瓶中，置于4℃冰箱中備用。

（2）松材線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)的制備：在無(wú)菌操作條件下，將灰葡萄孢（Botrytis cinerea）接種于察氏培養(yǎng)基上，21℃下避光培養(yǎng)7d，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿后，將松材線(xiàn)蟲(chóng)接種于該菌絲上進(jìn)行培養(yǎng)繁殖，26℃下避光培養(yǎng)5～7d［14]。通過(guò)貝爾曼漏斗法收集松材線(xiàn)蟲(chóng)［15]，無(wú)菌水離心洗滌3次，2 000r／min離心3次，每次3min。用無(wú)菌水將離心得到的松材線(xiàn)蟲(chóng)稀釋為1 000頭／mL的懸液備用。

（3）大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)J2的制備：將大豆品種‘黑60’種植在溫室的病原土壤中，孢囊成熟后挖出根系和根系周?chē)寥?，用過(guò)篩法［1]分離孢囊，選取新鮮飽滿(mǎn)成熟的褐色孢囊放在自制孵化池中用0.5%次氯酸鈉溶液消毒3min，再用無(wú)菌水沖洗3遍，加入自制孵化池中，在25℃4mmol／L ZnCl2溶液中孵化。4d左右會(huì)孵化出大量的J2，收集至滅菌的三角瓶中，置于4℃冰箱備用。

1.2.4 M1D14殺線(xiàn)活性測(cè)定

1.2.4.1 不同濃度放線(xiàn)菌M1D14菌株發(fā)酵液對(duì)不同線(xiàn)蟲(chóng)J2的影響

采用梯度稀釋法［16]，在滅菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入50μL不同濃度的M1D14菌株發(fā)酵液，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照，5μg／mL阿維菌素和苯線(xiàn)磷為陽(yáng)性對(duì)照，分別向處理和對(duì)照中加入50μL濃度為1 000條／mL的線(xiàn)蟲(chóng)，4次重復(fù)，放入25℃培養(yǎng)箱中，24h后記錄線(xiàn)蟲(chóng)死亡率，計(jì)算校正死亡率［17－19]，線(xiàn)蟲(chóng)死活判斷采用NaOH刺激法［20]。

下同。

1.2.4.2 不同處理放線(xiàn)菌M1D14發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2的影響

在滅菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中分別加入50μL經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌、0.22μm微孔濾膜過(guò)濾和未滅菌處理的不同濃度M1D14菌株發(fā)酵液，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照，分別向處理和對(duì)照中加入50μL濃度為1 000條／mL南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2，4次重復(fù)，放入25℃培養(yǎng)箱中，24h后記錄線(xiàn)蟲(chóng)死亡率，計(jì)算校正死亡率，線(xiàn)蟲(chóng)死活判斷采用NaOH刺激法。

1.2.4.3 0.22μm微孔濾膜過(guò)濾的 M1D14菌株發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化的影響

在滅菌的24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入100μL 0.22μm微孔濾膜過(guò)濾的不同處理濃度的 M1D14菌株發(fā)酵液，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照，5μg／mL苯線(xiàn)磷和阿維菌素為陽(yáng)性對(duì)照，分別向處理和對(duì)照中加入經(jīng)過(guò)10%NaClO消毒的100μL濃度為2 000個(gè)／mL南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵，4次重復(fù)，放入25℃培養(yǎng)箱中，10d后記錄卵的孵化率［21]。

孵化率＝（線(xiàn)蟲(chóng)孵化數(shù)／總卵數(shù)）×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線(xiàn)菌M1D14菌株發(fā)酵液對(duì)3種線(xiàn)蟲(chóng)活性的影響

從表1結(jié)果可見(jiàn)，M1D14菌株發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、松材線(xiàn)蟲(chóng)和大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)均有較好的抑制作用，對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)抑制效果最好、其次是松材線(xiàn)蟲(chóng)，對(duì)大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)效果最差。M1D14菌株4倍發(fā)酵液對(duì)大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)、南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、松材線(xiàn)蟲(chóng)的致死率均可達(dá)到100%；稀釋16倍后，對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、松材線(xiàn)蟲(chóng)的致死率仍為100%，但對(duì)大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)致死率顯著下降，僅為19.67%。菌株發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的抑制作用明顯高于對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的抑制作用，在稀釋36倍后，對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的致死率在80%以上，但對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的致死率低于10%。

表1 不同濃度發(fā)酵液處理24h對(duì)3種線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒力1）

2.2 放線(xiàn)菌M1D14菌株不同處理發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2的影響

從表2結(jié)果可知，經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌和0.22μm微孔濾膜過(guò)濾的菌株發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)均有較好的抑制作用，在稀釋16倍時(shí)，高溫高壓滅菌和微孔濾膜過(guò)濾對(duì)菌株的活性沒(méi)有顯著影響，但稀釋24倍后，微孔濾膜過(guò)濾的發(fā)酵液活性顯著高于高溫高壓滅菌處理的發(fā)酵液活性，顯著低于未經(jīng)滅菌處理的對(duì)照組活性。

表2 不同濃度發(fā)酵液處理24h對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒力1）

2.3 0.22μm微孔濾膜過(guò)濾的放線(xiàn)菌M1D14菌株發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化的影響

從表3結(jié)果可見(jiàn)，M1D14菌株發(fā)酵液不同處理對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化無(wú)明顯差異，其作用效果與無(wú)菌水相當(dāng)，略低于苯線(xiàn)磷和阿維菌素，沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化的抑制作用。

2.4 M1D14發(fā)酵液與對(duì)照藥劑阿維菌素和苯線(xiàn)磷殺線(xiàn)活性比較

由表4結(jié)果可知，M1D14菌株4倍稀釋發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、松材線(xiàn)蟲(chóng)和大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)的致死率都為100%；5μg／mL阿維菌素對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)致死率達(dá)100%，對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)致死率為83.36%，對(duì)大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)致死率為100%；5μg／mL苯線(xiàn)磷對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)致死率達(dá)100%，對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)致死率為23.6 8%，對(duì)大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)致死率為1 0 0%。M1D14菌株4倍發(fā)酵液對(duì)3種線(xiàn)蟲(chóng)都有很強(qiáng)的抑制作用，優(yōu)于5μg／mL阿維菌素或苯線(xiàn)磷的抑制作用。

表3 不同濃度菌株發(fā)酵液過(guò)濾處理后對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化的影響

表4 M1D14及對(duì)照藥劑對(duì)3種線(xiàn)蟲(chóng)J2的毒力1）

3 討論

由于放線(xiàn)菌菌株發(fā)酵液活性成分復(fù)雜，不同成分對(duì)不同線(xiàn)蟲(chóng)的活性位點(diǎn)作用也不盡相同，所以同一菌株的發(fā)酵液對(duì)不同種類(lèi)線(xiàn)蟲(chóng)的生物活性存在很大的差異。M1D14菌株經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2活性仍有很大的毒力，說(shuō)明該菌株發(fā)酵液殺線(xiàn)物質(zhì)耐高溫；經(jīng)過(guò)0.22μm微孔濾膜的發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2仍有毒力，說(shuō)明有效成分不是菌體本身，而是其代謝產(chǎn)物。M1D14菌株發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化沒(méi)有抑制作用，但是對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2具有強(qiáng)毒力，說(shuō)明M1D14對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的作用機(jī)理可能是觸殺作用，具體機(jī)理尚在進(jìn)一步的研究中。該菌株不同處理的發(fā)酵液與報(bào)道的其他生防菌株相比，使用濃度低，節(jié)約了生產(chǎn)成本，使其具有很好的應(yīng)用前景［4]。

菌株發(fā)酵液對(duì)于3種不同線(xiàn)蟲(chóng)J2的毒力作用與對(duì)照藥劑苯線(xiàn)磷或阿維菌素作用相當(dāng)。由于苯線(xiàn)磷為化學(xué)藥物，對(duì)環(huán)境有極大的影響，已被列為禁用農(nóng)藥；阿維菌素容易產(chǎn)生耐藥性、對(duì)于不同線(xiàn)蟲(chóng)作用有差異［22－23]。而該菌株發(fā)酵液對(duì)3種線(xiàn)蟲(chóng)J2都有很強(qiáng)的抑制作用，與對(duì)照藥劑相比具有對(duì)環(huán)境危害小、殺線(xiàn)蟲(chóng)種類(lèi)多、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)前景廣大。

高濃度海洋放線(xiàn)菌M1D14發(fā)酵液對(duì)3種重要植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)都有很強(qiáng)的抑制作用，是一株具有廣泛應(yīng)用前景的生物防治菌株。特別是M1D14發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)具有很強(qiáng)的殺線(xiàn)蟲(chóng)活性，如果應(yīng)用于生產(chǎn)，將對(duì)我國(guó)北方地區(qū)大棚蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防治產(chǎn)生重大影響。對(duì)該菌代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)的分離純化及安全性評(píng)價(jià)正在系統(tǒng)深入研究。

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