小菜蛾魚尼丁受體基因克隆及序列分析

孫麗娜， 芮昌輝， 袁會珠

（中國農業科學院植物保護研究所，農業部作物有害生物綜合治理綜合性重點實驗室，北京 100193）

魚尼丁受體（RyR）是目前所知最大的鈣離子通道，由4個相同的亞基組成，每個亞基的分子量約為560ku。在脊椎動物中存在3種亞型RyRs，而在昆蟲中僅存在一種魚尼丁受體［1]。二酰胺類化合物氟蟲雙酰胺和氯蟲苯甲酰胺對鱗翅目害蟲具有較高的活性，其作用機制與其他類殺蟲劑不同，它們可以結合昆蟲體內的魚尼丁受體，抑制昆蟲取食，引起蟲體收縮，使蟲體變粗變短，最終導致死亡［2－3]。自兩個化合物創制成功以來，不僅作用于魚尼丁受體化合物的合成備受關注，昆蟲魚尼丁受體的基因克隆及分子特性也因此成為焦點［4－5]。

小菜蛾［Plutella xylostella（L.）]是一種為害十字花科植物的世界性害蟲，也是對農藥產生抗性的最嚴重害蟲之一。據不完全統計，小菜蛾已經對70多種殺蟲劑產生了抗藥性，包括有機氯、有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯類，以及昆蟲生長調節劑和蘇云金桿菌（Bt）等殺蟲劑［6]。盡管二酰胺類化合物對小菜蛾具有較高的活性，但是有研究稱小菜蛾對其抗性產生較快。田間監測表明，在我國華南地區田間小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性與室內敏感小菜蛾相比已達到100多倍［7]；而在泰國，2008年至2011年間，小菜蛾對氟蟲酰胺的抗性從1.5倍增至4 817倍，對氯蟲苯甲酰胺的抗性從35.4倍增至152倍［8]。因此克隆小菜蛾魚尼丁受體基因可以為今后小菜蛾抗性機制研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

小菜蛾于室內采用無藥劑接觸甘藍苗連續飼養的技術飼養［9]。

1.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

取3齡小菜蛾幼蟲，用液氮研磨后，參照Trizol（Invitrogen）試劑說明書步驟提取總RNA。以反轉錄酶（PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa，大連，中國）合成cDNA第一鏈；利用TaKaRa 3′和5′RACE 試劑盒合成3′和5′RACE cDNA第一鏈。

1.3 引物設計

如圖1所示，小菜蛾RyR序列可以由18個片段重疊組合得到。本試驗引物設計根據美國國家生物工程信息中心（NCBI）數據庫中家蠶B.m.（Bombyx mori）、煙芽夜蛾 H.v.（Heliothis virescens）、黑腹果蠅D.m.（Drosophila melanogaster）、桃蚜 M.p.（Myzus persicae）、棉蚜A.g.（Aphis gossypii）、玉米飛虱P.m.（Peregrinus maidis）、埃及伊蚊A.a（Aedes aegypti）這個7個物種魚尼丁受體基因氨基酸中保守序列來設計簡并引物。根據簡并引物的PCR測序結果，設計特異性引物，引物見表1。所有引物的合成由北京六合華大基因科技有限公司完成。

圖1 PCR擴增和克隆小菜蛾魚尼丁受體（Px－RyR）cDNA片段示意圖

表1 克隆小菜蛾魚尼丁受體基因的引物1）

1.4 PCR擴增

片段S1～S19的擴增，按照TaKaRa Ex Taq試劑盒說明進行，按照不同的引物及擴增片段的長度設置不同的PCR反應程序。

cDNA 3′末端快速擴增（3′RACE），outer PCR和inner PCR的反應條件均為：94℃3min；94℃30s，65℃→50℃（－0.5℃／循環）30s，72℃1min，30個循環；94℃30s，50℃30s，72℃1min，15個循環，72℃10min。

cDNA 5′末端快速擴增（5′RACE），outer PCR反應條件為：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，25個循環；72℃10min。Inner PCR反應條件為：94℃3min；94℃30s，68℃1min，30個循環；72℃10min。

將目的片段克隆于pMD?19－T Simple Vector載體內，選取陽性克隆測序。序列測定由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.5 序列測定及分析

利用DNAstar和Mega5.0等軟件進行序列分析和比較。利用美國國家生物工程信息中心（NCBI，http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／）的BLAST網絡工具與GenBank中的其他物種序列進行比較，確定目標產物的真實可靠性。分子量和等電點（molecular weight／isoelectric point）MW／pI在ExPaSy website（http：∥us.expasy.org／tools／pitool.htm）預測計算。跨膜區域預測可以于www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM 進行分析，蛋白質二級 結 構 于 http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／cdd／wrpsb.cgi和http：∥www.expasy.org／tools／scanprosite／分析。

2 結果與分析

根據NCBI中昆蟲魚尼丁受體基因序列設計簡并引物，通過RT－PCR擴增得到了目標片段，而后根據目的片段序列，再設計特異性引物，繼續進行RT－PCR擴增。進一步進行5′RACE和3′RACE擴增，得到兩端序列后，通過小菜蛾所有片段的序列拼接得到小菜蛾魚尼丁受體基因cDNA序列全長。小菜蛾魚尼丁受體基因全長為15 748bp，其中5′端非閱讀區267bp，3′端非閱讀區109bp，開放閱讀區15 372bp。開放閱讀區編碼5 123個氨基酸殘基（GenBank登錄號為JF927788），預測其分子量約為579.39ku，等電點為5.45。

對預測的Px－RyR氨基酸序列與其他物種RyR基因氨基酸序列進行多重比對，結果表明Px－RyR與其他物種RyR存在很高的同源性如表2。與煙芽夜蛾（H.v.）、家蠶（B.m.）、桃蚜（M.p.）、棉蚜（A.g.）、玉米飛虱（P.m.）、果蠅（D.m.）、鼠（M.m.）骨骼肌RyR1、鼠心肌RyR2及鼠RyR3的相似性分別為92%、92%，77%、77%、80%、78%、45%、47%、46%。

表2 Px－RyR與其他物種RyRs序列相似性 %

通過MEGA 5.0利用鄰接法對22個物種RyR蛋白質進行進化樹分析（Bootsrap為1 000個重復），從而通過RyR氨基酸多態性來揭示這些物種間RyR蛋白質的進化關系。由圖2看出，22個物種間的RyR基本分兩大類，即脊椎動物中一類，無脊椎動物中一類。圖2可以明顯看出，小菜蛾RyR與煙芽夜蛾和家蠶RyR關系最近。

圖2 Px－RyR與其他21個物種間RyR蛋白質進化樹分析

根據氨基酸二級結構預測小菜蛾魚尼丁受體基因存在6個跨膜區域，位于第4 474～5 022氨基酸之間。這6個氨基酸序列分別為（如表3）：Phe4474－Leu4496；Asp4655－Tyr4676；Val4734－Leu4756；Phe4875－Ala4897；Leu4923－Phe4945；Ile5003－Ile5022。除了跨膜區域外，小菜蛾魚尼丁受體蛋白還存在其他結構域。如RyR結構域（重復序列）、細胞內鈣離子釋放通道結構域、鈣離子結合的EF－hand結構域、MIR結構域（因該結構域同時存在于甘露糖轉移酶、三磷酸肌醇受體和魚尼丁受體中而命名）、Spla／RYanodine receptor SPRY結構域、離子通道結構域、魚尼丁受體和三磷酸肌醇受體相似結構域、似SPRY結構域及一些未命名的結構域［10]。

表3 小菜蛾RyR跨膜區域序列

3 結論與討論

魚尼丁受體是最大的鈣離子釋放通道之一，在肌肉興奮收縮偶聯中具有重要作用，在很多細胞中具有第二信使的作用。魚尼丁受體因其所具有的特性，近30年來在醫學界備受關注，而近10年來在殺蟲劑研究領域也深受廣大研究者關注［1]。因此克隆昆蟲魚尼丁受體基因對作用于魚尼丁受體新化合物的設計及害蟲抗藥性研究至關重要。在本研究中，筆者克隆了小菜蛾魚尼丁受體。但其具有較大分子量，不易表達。

Puente等［11]克隆了編碼煙芽夜蛾RyR C－末端1 172個氨基酸，通過比對發現其與哺乳動物3種亞型的RyRs具有45%～47%的同源性，與桃蚜（M.p.）、棉蚜（A.g.）、玉米飛虱（P.m.）、果蠅（D.m.）的同源性分別為76.8%、77.5%、79.6%、78.2%。而本文中小菜蛾RyR基因與其他物種同源性關系分析表明，小菜蛾RyR與煙芽夜蛾RyR和蠶相似性高達92%，這與3種昆蟲同屬鱗翅目有關。

根據預測的氨基酸二級結構分析，小菜蛾魚尼丁受體基因C端存在6個跨膜區域，這也是魚尼丁受體基因的特性之一。有研究認為魚尼丁受體基因存在6～8個跨膜區域，也有研究認為存在4～12個跨膜區域［12－14]，然而魚尼丁受體基因跨膜區域的特定結構尚未明確。Puente等［11]研究表明煙芽夜蛾C－末端存在5個較高的疏水性區域，這5個區域在氨基酸序列的位置為：516～532（M′）、704～720（M1）、782～798（M2）、972～988（M3）和1 054～1 070（M4），即為5個跨膜區域。煙芽夜蛾RyR與小菜蛾RyR跨膜區域的不同，可能是由于計算方式不同引起的。小菜蛾RyR基因6個跨膜區的親水性指數為1.5～2.6，然而TM4的親水性指數僅0.6，這與Zorzato等［14]推測的12個跨膜區域的親水性指數在0.8～2.9之間基本一致。

Puente等［11]研究還表明在煙芽夜蛾RyR跨膜區M3和M4之間存在一個鈣離子釋放通道的成孔結構域GVRAGGGIGD，同樣的結構域也存在于小菜蛾RyR基因C－末端的TM5和TM6之間。然而在兔心肌RyR中也存在這個結構，但是GXRXGGG－XGD第8個氨基酸殘基I在兔心肌RyR中為第4897個氨基酸 T［15]。

此外，一個重復序列出現4次不僅體現在小菜蛾魚尼丁受體基因中，也存在于脊椎動物的骨骼肌和心肌魚尼丁受體中［14－15]。第一個重復區域有94個殘基，位于859～952氨基酸之間；第二和第三個重復區域均有95個氨基酸殘基，位于972～1 066和2 838～2 932氨基酸之間；第四個重復區域有89個氨基酸，位于2 964～3 052氨基酸之間。比對重復序列（如圖3），根據二級結構預測，小菜蛾魚尼丁受體基因的重復序列是α－α型，而在RyR1和RyR2的重復序列呈現的是β－α－β－α型。在小菜蛾魚尼丁受體基因中4個重復序列的相似性有33%，在哺乳動物RyR1和RyR2中重復序列的相似性為28%，然而這一區域的功能尚未得到驗證。

微摩爾濃度的細胞質Ca2＋可以激活RyRs，毫摩爾的Ca2＋可以抑制RyRs。這些雙向作用可能是由不同親和性的Ca2＋結合位點的相互作用引起。在鱗翅目昆蟲的RyRs中存在PPPEPTEEE氨基酸束，而在兔RyR1這也存在一個脯氨酸和谷氨酸豐富的氨基酸束PEPEPEPEPEPE（4 488～4 499）［16]。45Ca2＋的平衡結合試驗表明龍蝦 RyR與哺乳動物RyR1和RyR2的相應此結構域包含了Ca2＋鈍化RyR的結合位點即位于EF－hand結構域鈣離子結合位點［17]。

圖3 重復序列比對結果圖

ATP與RyR1存在3個可能的結合位點，結合位點的氨基酸序列為GXGXXG［18]。在煙芽夜蛾的RyR中3個位點分別為GVGLEG、GEGGEG、GSGESG。而小菜蛾中僅有1個相似位點位于RyR的4 005～4 010（GVGLEG）。此外與煙芽夜蛾其余兩個位點的位置，小菜蛾的氨基酸序列分別為4 683～4 688（AEPGEG），4 710～4 715（GSGEE－）。在后兩個位點區域出現了一個突變位點，一個缺失位點，可能是由于物種間的差異造成，或者是ATP與小菜蛾RyR就存在一個結合位點。

另一個對哺乳動物RyRs具有重要調節作用的是具有雙向功能的鈣調蛋白。脫鈣鈣調蛋白（Ca2＋游離鈣調蛋白）激活的同時，鈣調蛋白（Ca2＋結合鈣調蛋白）抑制RyR鈣離子通道［19]。根據有關研究推斷4124HS RLWDAVGGFLFLFSHMQDKLSKH4148可能是鈣調蛋白與RyR的結合位點［11]。

Ulich等［20]認為氟蟲雙酰胺與RyR的結合不受魚尼丁的影響，Kenta等［21]研究表明，氟蟲雙酰胺與鱗翅目昆蟲RyR的結合位點在C－末端4 111～5 084氨基酸之間，因此推測氟蟲雙酰胺與RyR的結合位點不同于魚尼丁的結合位點。可見，有關二酰胺類殺蟲劑的作用位點仍需進一步研究。因此小菜蛾魚尼丁受體基因的克隆為此提供了有利的研究基礎，也為今后小菜蛾對二酰胺類化合物產生的抗性研究提供理論支持。

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