北京地區番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性檢測

李興紅， 喬廣行， 黃金寶， 林 雪， 劉建華＊

（1.北京市農林科學院植物保護環境保護研究所，北京 100097；2.北京市大興區植保植檢站，北京 102600）

由灰葡萄孢（BotrytiscinereaPer.ex Fr.）引起的番茄灰霉病是保護地番茄上的重要病害，在春季發生，主要引起果實腐爛，也危害葉片和花，嚴重時造成減產30%～50%?；瘜W防治是防治番茄灰霉病的重要手段之一，所使用的殺菌劑主要有苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、氨基甲酸酯類及其混劑和苯胺基嘧啶類等。在生產上灰霉病菌對殺菌劑多菌靈、腐霉利和乙霉威等產生抗藥性非常普遍［1－4］，目前生產上控制番茄灰霉病菌的藥劑主要是嘧霉胺及復配制劑。

嘧霉胺屬于苯胺基嘧啶類殺菌劑，20世紀80年代初由安萬特公司研發成為產品問世。1998年在中國登記商品施佳樂原藥，目前已在中國登記的有20%和40%嘧霉胺可濕性粉劑，對由灰葡萄孢引起的灰霉病有良好的抑制作用［5］。

苯胺基嘧啶類殺菌劑作用位點單一，灰葡萄孢對嘧霉胺的抗藥性為單基因抗性［6］，抗藥性風險高。嘧霉胺自1998年開始在中國使用后4年，紀明山報道了遼寧省番茄灰霉病菌對嘧霉胺產生了抗藥性［7］，江蘇［8］、浙江［9］也相繼報道了灰葡萄孢對嘧霉胺產生了抗藥性。

北京地區番茄灰霉病害的發生和危害也十分嚴重，目前生產上主要使用嘧霉胺等殺菌劑防治，北京地區番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性如何，生產上應如何合理用藥，針對該問題作者于2009年12月—2010年5月間對北京12個郊區縣番茄灰霉病菌對嘧霉胺抗藥性進行了檢測，以明確番茄灰霉病菌對該類藥劑的抗藥性水平，為正確指導農民用藥，減緩病原菌抗藥性的產生提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株的采集與分離

2009年12月－2010年5月，在北京12個郊區縣日光溫室或塑料大棚內，采集番茄病樣150個，將病樣保濕產生新鮮的子實層，從中挑取單個分生孢子進行培養，純化得到109個單孢菌株（表1），斜面和濾紙片法低溫（－20℃）保存，供抗藥性測定使用。

1.2 供試藥劑與培養基

將95%嘧霉胺原粉（由江蘇利民化工股份有限公司提供）溶于丙酮，配制10 000μg／mL的母液，置于4℃冰箱中存放備用。

L－asp培養基：K2HPO4、MgSO4·7H2O各1g分別溶于30mL去離子水中，將兩者混合后用10mol／L HCl溶解沉淀物，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，天冬酰胺2g，葡萄糖22g，瓊脂20g，加蒸餾水至1L。

1.3 含藥培養基制備

將嘧霉胺母液系列稀釋，按一定的比例加入到培養基中，制成系列濃度的含藥培養基（在培養基滅菌后，溫度降到40℃左右時加入藥劑）。

1.4 番茄灰霉病菌對嘧霉胺敏感性的測定

采用菌絲生長速率法，將所有單孢菌株在含藥平板上進行對嘧霉胺的抗藥性測定?？顾幮詼y定設置5～7個梯度濃度，以不加藥劑的為對照；每處理重復3次；在新鮮的菌落邊緣打取直徑5mm的菌餅，接種于含藥培養基的平板中央，在23℃黑暗培養72h，測量菌落直徑。根據菌落在不同濃度藥劑平板上的線性生長速率，計算出各濃度下對病原菌的生長抑制率，用統計軟件DPS進行處理，求出EC50值（抑制中濃度）、EC90值、毒力回歸方程及相關系數，并統計各地區的敏感抗性菌株的發生頻率。

表1 供試番茄灰霉病菌菌株及其來源

1.5 抗藥性程度劃分標準

抗性水平依據紀明山等［7］的敏感基線值（0.091 1μg／mL）進行判別，當菌株的EC50值小于敏感基線的5倍時，即EC50小于0.455 5μg／mL時為敏感菌株；當菌株的EC50值處于敏感基線的5倍和10倍之間時，即EC50在0.455 5～0.911μg／mL之間時為低抗菌株，當菌株的EC50值處于敏感基線10倍和40倍之間，即EC50在0.911～3.644μg／mL時為中抗菌株；當某菌株的EC50值大于敏感基線的40倍，即EC50高于3.644μg／mL時為高抗菌株。

2 結果與分析

2.1 北京地區灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性

經分離共獲得109株番茄灰霉病菌，采用菌絲生長速率法測定嘧霉胺對各菌株的EC50值。結果表明（表1）：北京地區郊區縣的番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性已經產生分化，抗性比例較高，抗性菌株出現的比例高達82.57%，其中高抗菌株為主所占比例為65.14%，其次為低抗菌株和中抗菌株，分離比例分別為10.09%和7.34%；敏感菌株所占比例為17.43%?？剐跃昕剐运阶罡叩腂JPGngx15－1EC50達到257.390 3μg／mL，與最敏感菌株相比（EC50為0.050 5μg／mL），EC50值是敏感菌株的5 096倍。說明北京地區番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗性非常普遍，且以高抗菌株為主；在該地區應采用新型替代藥劑。

表2 北京地區番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗性表型及其頻率1）

1）HR表示高抗，MR表示中抗，LR表示低抗，S表示敏感。

2.2 北京地區不同區、縣番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗性差異

比較北京地區各郊區縣抗嘧霉胺番茄灰霉菌株的頻率和程度，結果顯示（圖1）：不同郊縣番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性存在明顯差異，這可能與各區縣的種植方式和用藥水平有關。門頭溝區、密云縣、延慶縣、懷柔區和平谷區番茄灰霉病菌存在抗性問題較為突出，抗性菌株發生頻率均為100%，抗性程度也較高，高抗菌株所占比例在80%以上；通州區的抗性菌株發生頻率為95%，且都為高抗菌株，5%的菌株為敏感菌株；與之相反，海淀區和朝陽區的菌株均為敏感菌株；房山區、大興區、順義區和昌平區的抗性菌株頻率居中，依次為54.55%、77.78%、85%和88.88%；其中，房山區的抗性菌株中未出現高抗菌株，而后3個區的抗性菌株中以高抗菌株為主，所占比例分別為66.67%、70%和44.44%。

圖1 北京市不同區縣番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性測定結果

3 結論與討論

試驗結果表明，北京地區自20世紀末開始使用嘧霉胺防治番茄灰霉病，在10余年的時間內，番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性非常普遍，抗性菌株出現的比例高達82.57%，抗性水平以高抗為主，在抗性菌株中，高抗菌株所占比例達78.89%，抗性水平最高的菌株EC50是最敏感菌株EC50值的5 096倍；不同區縣番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性存在差異，這可能與番茄種植方式和用藥水平有關，海淀區、朝陽區未檢測到抗性菌株，房山區未檢測到高抗菌株，這兩區的病樣分別采自巨山農場、朝陽農藝園和韓村河蔬菜基地，巨山農場是有機農場，朝陽農藝園和韓村河蔬菜基地都是加溫溫室，灰霉病發生較輕，用藥較少；而門頭溝區、密云縣、延慶縣、懷柔區、平谷區、大興、順義和通州等區縣的番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性普遍，抗性水平高，這些地區番茄主要是不加溫日光溫室栽培，灰霉病防治多采用嘧霉胺，藥劑的長期施用對病菌的選擇壓力導致抗藥性產生。

灰葡萄孢對嘧霉胺的抗藥性是由單基因抗性控制［6］，易形成抗藥性，這種現象在國內外生產實踐中得到證實，本研究結果與相關報道相符。

有研究表明，灰霉病菌對嘧霉胺的抗性可穩定遺傳，抗性菌株與敏感菌株的適應性無差異，表現在菌絲生長和產孢能力等方面，因此，嘧霉胺在北京地區防治番茄灰霉病應慎重使用，抗性嚴重的門頭溝區、密云縣、延慶縣、懷柔區和平谷區、通州等區縣應停用，使用替代型殺菌劑及其他生態措施和生物農藥；在抗性水平低的區縣應減少嘧霉胺的使用量，交替使用新型殺菌劑及其他生物、生態等綜合控制技術，減緩抗藥性的產生。

［1］Elad Y，Shabi E，Katan T.Negative cross resistance between benzimidazole and N－phenylcarbamate fungicides and control ofBotrytiscinereaon grapes［J］.Plant Pathology，1988，37（1）：141－147.

［2］Elad Y，Yunis H，Katan T.Multiple fungicide resistance to benzimidazole，dicarboximides and diethofencarb in field isolates ofBotrytiscinereain Israel［J］.Plant Pathology，1992，41（1）：41－46.

［3］李林，徐作珽.山東省灰霉菌對速克靈、多菌靈田間抗性檢測研究初報［J］.山東農業科學，1997（3）：32－35.

［4］林柏青，姚技強，朱國仁.北京郊區大棚蔬菜灰霉病菌的抗藥性檢測［J］.植物保護，1998，24（2）：30－31.

［5］馬忠華，葉鐘音.嘧啶胺類殺菌劑的作用機制［J］.農藥科學與管理，1997，19（1）：30－32.

［6］Hilber U W，Hilber B M.Genetic basis and monitoring of resistance ofBotryotiniafuekelianato anilinopyrimidines［J］.Plant Disease，1998，82（5）：496－500.

［7］紀明山，祁之秋，王英姿，等.番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性［J］.植物保護學報，2003，30（4）：396－399.

［8］賈曉華.番茄灰霉病菌和油菜菌核病菌對嘧霉胺的敏感性基線及番茄灰霉病菌抗藥性研究［D］.南京：南京農業大學，2004.

［9］印利梅，禮茜，李紅葉.浙江省茄科蔬菜灰霉病菌對嘧霉胺的抗性［J］.浙江農業學報，2007，19（2）：123－126.