臨床就診犬布魯氏菌病血清學調查

陳金娟 天津農學院動物科學系 300384

1 緒論

犬布魯氏菌病是由布魯氏菌侵入機體引起的傳染變態反應性人畜共患傳染病，國內外均有犬感染該病的報道。

犬布魯氏菌病的檢測主要采用國際標準中規定的虎紅平板凝集試驗 （RBPT）、試管凝集試驗（SAT）和補體結合試驗（CFT）[1]。這些方法具有敏感性高、特異性強的特點。但由于試管凝集試驗和補體結合試驗操作繁瑣、費時，抗原、血清用量較大，試管、吸管反復刷洗，在標本量大的布魯氏菌病監測中很不方便，微量凝集試驗也在不斷改革發展并日臻完善。微量凝集試驗檢測布魯氏菌病抗體最早見于1988年的文獻，方堅勇等用96孔V型血凝板、12號去針尖頭接乳膠頭為移液器，進行微量試管凝集試驗，檢測牛布魯氏菌病抗體并進行卡方檢驗，得出微量法和試管法的檢出率準確性一致的結論[2-3]。

1.1 布魯氏菌

1.1.1 布魯氏菌簡介

布魯氏菌又叫布氏桿菌，為革蘭氏陰性短小桿菌，初次分離時多呈球狀、球桿狀和卵圓形。專性需氧，但許多菌株，尤其是在初代分離培養時尚需5%～10%的二氧化碳。最適生長溫度為37℃，最適pH為6.6～7.4。該菌傳代培養后漸呈短小桿狀，菌體無鞭毛，不形成芽胞，毒力菌株可有菲薄的莢膜。1985年世界衛生組織(WHO)布魯氏菌病專家委員會將布魯氏菌屬分為6個種19個生物型 [4]，即羊種（生物型 1～3），牛種（生物型 1～7.9），豬種（生物型1～5）及綿羊型副睪種，沙林鼠種，犬種（各1個生物型）。我國已分離到羊種、牛種、豬種、綿羊型副睪種和犬種各1個型。臨床上以羊、牛、豬3種易感性最強，羊種致病力最強。

1.1.2 流行情況

布魯氏菌可引致多種動物和人的布魯氏菌病，細菌可經氣溶膠傳播，是潛在的生物武器。一年四季均可發病，流行區在發病高峰季節（春末夏初）可呈點狀暴發。常呈地方性流行。病畜主要通過流產物、精液和乳汁排菌，污染環境。羊、牛、豬的易感性最強。母畜比公畜，成年畜比幼畜發病多。帶菌動物尤其是病畜的流產胎兒、胎衣是主要傳染源。以感染羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌最為嚴重。

本病流行于世界各地，我國多見于東北、西北等牧區。該病于20世紀50～60年代在中國有較嚴重流行，到20世紀90年代下降為0.01%。然而從1993年起布魯氏菌病疫情出現了反彈，人間布魯氏菌病疫情回升幅度較大，畜間布魯氏菌病也呈上升情況。2003～2005年，農業部對12個省市部分奶牛場的4108份乳樣進行布魯氏菌病檢測，從10個省檢出203份陽性乳樣，陽性率達4.94%。

1.1.3 布魯氏菌病的防控

我國推廣"檢疫、免疫、捕殺病畜"的綜合性防治措施，同時針對疾病流行的3個環節采取相應措施：非疫區以監測為主；穩定控制區以監測凈化為主；控制區和疫區實行監測、撲殺和免疫相結合的方法。

免疫接種：疫情呈地方性流行的區域，應采取免疫接種的方法。免疫接種范圍內的牛、羊、豬、鹿等易感動物。根據當地疫情，確定免疫對象。

檢疫：異地調運的動物，必須來自于非疫區，應憑當地動物防疫監督機構出具的檢疫合格證明調運。動物防疫監督機構要對調運的種用、乳用、役用動物進行實驗室檢測。檢測合格后，方可出具檢疫合格證明。調入后應隔離飼養30d，經當地動物防疫監督機構檢疫合格后，方可解除隔離。

人員防護：飼養員每年要定期進行健康檢查。發現患有布魯氏菌病的應調離崗位，及時治療。

防疫監督：布魯氏菌病監測合格，應為奶牛場、種畜場發放《動物防疫合格證》或審驗合格的證明。動物防疫監督機構要加強轄區內奶牛場、種畜場的檢疫凈化情況的監督檢查。鮮奶收購點（站）必須憑奶牛健康證明收購鮮奶。

1.2 布魯氏菌病的檢測方法

布魯氏菌病常表現為慢性或隱性感染，其診斷和檢疫主要依靠血清學檢查及變態反應。目前血清學檢查是診斷布魯氏菌病的常用方法[5-8]，主要有虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。

1.2.1 虎紅平板凝集試驗

此法簡便，快速易行，比較敏感，適合于現場大批檢疫時做篩選檢查。但該法具有一定的假陽性，所以不宜做最后診斷。

1.2.2 試管凝集試驗

試管凝集試驗自Wright建立以來一直是各國診斷布魯氏菌病的常規血清學診斷方法，在布魯氏菌病的檢測和控制規劃中發揮了巨大的作用。試管凝集試驗操作簡便，判定容易，有廣闊的應用前景，我國將其列為動物布魯氏菌病診斷的國家標準。然而，《動物布魯氏菌病診斷技術》(GB/T18646～2002)規定的方法是早些年根據當時的實驗室儀器設備條件建立的，隨著實驗儀器設備的發展與更新，近年來認為試管凝集試驗可以改進為微量法在96孔微量板上操作[9]，而且比傳統的試管凝集試驗具有許多優點。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

用ELISA檢測標本中的抗原或抗體是20世紀70年代初創立的一項技術，主要有間接ELISA試驗和競爭ELISA試驗。該技術具有靈敏度高、特異性強、自動化程度高、測定成本低等優點，將酶聯反應的高效性與免疫反應的特異性、高度專一性有機結合成為具有推廣應用價值的技術[10]。Cav-leson等(1976)首次應用ELISA檢測牛布魯氏菌病抗體并發現其敏感性比試管凝集試驗高10～100倍。谷登峰等(1989)建立了一種 Dot-ELISA和單克隆抗體相結合的檢測方法，對10頭健康牛和2個可疑奶牛場的15份奶牛血清進行快速診斷，結果在傳統的試管凝集試驗均為陰性的情況下，ELISA陽性率為14.78%。證明該方法具有特異、敏感、實用的優點。

1.3 實驗研究的目的、方法及預期目標

布魯氏菌病是我國乙類傳染病。布魯氏菌病主要侵害機體淋巴系統和生殖系統，家畜患病后可以發生胎膜發炎、不孕、不育、流產、睪丸炎、乳腺炎以及各種組織病變等。人感染后主要表現為波狀熱、多汗、關節痛、神經痛及肝、脾腫大、關節變形等，病程較長且易復發。該病廣泛分布于世界各地尤其是畜牧業發達的國家和地區。據調查，全世界200多個國家和地區中已有170多個存在布魯氏菌病疫情，每年造成的損失高達數百億美元[11]。

2 試驗材料與方法

2.1 試驗材料

收集100只前來天津農學院動物醫院就診的、需靜脈采血檢驗的臨床犬的血樣。

2.1.1 主要儀器

移液器：北京雷勃爾離心機有限公司Y91921 20-200μl

北京雷勃爾離心機有限公司 Y74797 10-100μl

北京雷勃爾離心機有限公司 Y73441 100-1000μl

離心機：北京雷勃爾離心機有限公司 LZD 5-D

2.1.2 主要試劑

苯酚：天津市永大化學試劑有限公司 批號：Z0110418

氯化鈉注射液（0.9%：吉林科倫康奈爾制藥有限公司 批號：S070737HZ

犬布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原：中國獸醫藥品監察所 批號：201001

犬布魯氏菌病高免血清：中國獸醫藥品監察所批號：2011-3

犬布魯氏菌病陽性血清：中國獸醫藥品監察所批號：2009-1

2.1.3 其他器械用品

酒精棉球、無齒鑷子、2ml注射器、橡膠管、一次性使用塑料試管滴管、移液器槍頭、載玻片、牙簽、恒溫箱、顯微鏡。

2.2 試驗方法

2.2.1 樣品采取

對來天津農學院動物醫院檢驗室抽血化驗的臨床就診犬利用無菌操作采集靜脈血 （2～2.5ml），詢問畜主患病犬的主要癥狀、年齡、性別、品種、繁育史并對收集的血樣進行編號，將數據記錄于登記表。采集的血樣立即用離心機（3600r/min 2～3min）離心，吸取上層血清，-20°C冷凍保存。

2.2.2 虎紅平板凝集試驗

待測血清預處理：將冷凍過的待測血清放入恒溫箱內10min左右，使其解凍。

虎紅平板凝集試驗操作方法：用微量移液器分別取2滴犬布魯氏菌病虎紅平板凝集陽性抗原于載玻片上，再分別取犬布魯氏菌病陽性血清、犬布魯氏菌病陰性血清各1滴與上述抗原混合，并用牙簽攪拌均勻（見圖1）。于另一塊載玻片上分別取3滴犬布魯氏菌病虎紅平板凝集陽性抗原，將編號為001、002、003的待測血清各1滴與上述抗原混合，用牙簽攪拌均勻，3-5min內觀察結果（見圖2）。以此類推，繼續進行編號004～100的待測血清的試驗。

虎紅平板凝集試驗結果判定：在陽性血清與陽性抗原出現明顯凝集顆粒，陰性血清與陽性抗原之間仍均勻渾濁的前提下，待測血清如與陽性抗原出現明顯凝集顆粒，則判為陽性；如均勻渾濁，則判為陰性；介于二者之間則為可疑。

2.2.3 微量凝集試驗

對虎紅平板凝集試驗呈陽性或可疑的血清抗體進行定量檢測。

血清的稀釋和加入抗原：準備好96孔板。第一孔加入115μl石炭酸生理鹽水，第二孔不加，第三、四、五管各加入20μl，第六、七孔不加，第八孔加20μl。其中第六、七、八孔分別是陰性血清（Abˉ）、陽性血清（Ab＋）、抗原對照組。用移液器吸四孔中吸取20μl加入第五孔，第五孔混勻后棄去20μl。第六、七管分別加入20μl待測血清，第八孔不加。這樣從第二孔到第五孔血清稀釋度分別為1∶25、1∶50、1∶100、1∶200。血清稀釋后即可加入抗原。每孔加入20μl陽性抗原，震蕩均勻。見表 1。

記錄結果：將96孔板充分震蕩后置于37°C～38°C恒溫箱中恒溫30min，觀察并記錄結果。

微量凝集試驗結果判定：根據各孔中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集塊的形狀，來判定凝集反應的程度。

3 實驗結果

3.1 虎紅平板凝集試驗結果∶陽性血清0份（0/100）,可疑血清 5 份（5/100），陰性血清 95 份。

3.2 微量凝集試驗結果∶陽性血清0份（0/100）,可疑血清0份（0/100），陰性血清100份。

表 2 虎紅平板凝集和微量凝集試驗結果

4 討論

4.1 對虎紅平板凝集試驗和微量凝集試驗結果的分析

在100份臨床就診犬血清中，應用虎紅平板凝集試驗測得可疑率為5%，而微量凝集試驗則無可疑病例，由此可以從側面反映出微量凝集試驗與虎紅平板凝集試驗相比具有較好的敏感性和特異性。利用顯微鏡觀察試驗結果，就免去了人為主觀因素的影響，對結果的判斷更為準確和客觀。

4.2 關于虎紅平板凝集試驗的準確性

布魯氏菌誘導動物產生最多的抗體是IgG1，其次為IgM抗體，虎紅平板凝集試驗和微量凝集試驗檢測的主要是IgM抗體，容易受到動物體內其它IgM抗體的干擾。虎紅平板凝集試驗特異性不高，受試驗溫度、凝集時間相對較短和人為主觀因素的影響，不易準確判定結果。

4.3 關于微量凝集試驗的準確性

微量凝集試驗是我國布魯氏菌病的法定檢測判定方法，但是該方法由于操作繁瑣、費時，不適于在牛、羊飼養場現場采用。而本實驗采用的微量凝集試驗在等比例減少了試驗中各試劑的量之后，可以在一定程度上縮短反應時間。

5 結論

100 只隨機抽樣臨床就診犬的犬種布魯氏菌感染率為0；微量凝集試驗借助顯微鏡來觀察結果，可減小因肉眼觀察帶來的試驗誤差，提高試驗結果的準確性。

［1］國家技術監督局，中華人民共和國衛生部.GB15988-1995布魯氏菌病診斷標準及處理原則［S］.1995.

［2］衛生部政策法規司.WS269-2007.布魯氏菌病診斷標準［S］.北京：人民衛生出版社，2007.

［3］方堅勇，劉勝紅.用微量試管凝集試驗檢測布魯氏菌病抗體的研究［J］畜牧獸醫，1998，39（3）：131.

［4］吳清民.獸醫傳染病學[M].北京：中國農業大學出版社，2002：187～193.

［5］ Morgan WJB，MacKinnon DJ，Lawson JR，et al.The rose bengalplate agglutination test in the diagnosis of brucellosis［J］.VetRec，1969，85(23):636～641.

［6］ Nicoletti P.An evaluation of serologic tests used to diagnose.Brucellosis in buffaloes(Bubalus bubalis)［J］.Trop Anim Health Prod，1992，24(1):40～44.

［7］ Mateu deAntonio EM，Martín M，CasalJ.Comparison of serologictests used in canine brucellosis diagnosis［J］.J Vet DiagnInvest，1994，6(2):257～259.

［8］宋翠平，徐輝，王志亮，等.檢測布魯氏菌病的四種血清學方法比較及國際標準單位的應用［J］.中國動物檢疫，2003，20（2）:25～27.

［9］世界動物衛生組織,陸生動物診斷試驗和疫苗手冊(哺乳動物、禽鳥與蜜蜂)［M］.農業部獸醫局/中國動物衛生與流行病學中心譯.第五版.2007.

[10] Barbro S，Wilfried K，Uwe T.A simple touch-downpolymerasechain reaction for the detection of canineparvorvirus and Feline panleukopenia Virus in feces.[J].Journal of Virological Methods，1995，55:427-433.

［11］Gul ST，Khan A.Epidemiology and epizootology ofbrucellosis:a review ［J］.Palostam Vet.J.2007，27(3):145～151.