舒郁散對慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為及海馬BDNF表達(dá)的影響*

陳利平 王發(fā)渭 孫志高 黃泉智 柯清林

（1.解放軍總醫(yī)院海南分院，海南 三亞 572004；2.解放軍總醫(yī)院學(xué)員隊，北京 100853）

舒郁散具有抗抑郁作用，可調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽以及海馬5-HT受體表達(dá)而發(fā)揮抗抑郁作用［1-2］。本研究選用慢性不可預(yù)見的應(yīng)激抑郁模型，觀察舒郁散對模型大鼠行為的影響，以及對海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）蛋白表達(dá)的影響，以期為抑郁癥的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 60只Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物號為SCXK-京-2009-0007。大鼠先用Open-Field法作行為學(xué)評分［3］，選擇得分相近的50只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、百憂解組（20 mg/次）、舒郁散小劑量組（含生藥0.5 g/mL）、舒郁散大劑量組（含生藥5.0 g/mL），每組10只。正常對照組每籠飼養(yǎng)5只，其他組每籠飼養(yǎng)1只。

1.2 藥物與試劑 舒郁散處方由中國人民解放軍總醫(yī)院中醫(yī)科提供，由柴胡、棗仁、郁金、梔子等組成，上藥浸泡、煎煮，過濾，于80℃恒溫水浴中濃縮成含生藥量5 g/mL藥液，存冰箱備用，使用時蒸餾水稀釋灌胃；百憂解膠囊，禮來蘇州制藥有限公司分裝，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字2006017。BDNF（批號：909083W）北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。二抗顯色試劑盒為En Vision Detection Kit基因科技 （上海）有限公司產(chǎn)品（Code No：GK500705）。全自動真空脫水機(jī)（LEICAASP300）、組織包埋機(jī)（LEICAEG1140H）、石蠟切片機(jī)（LEICARM2135）、展片機(jī)（LEIC-AHI1210）均為德國LEICA公司產(chǎn)品。光學(xué)顯微鏡為日本OLYMPUSBX60顯微鏡。APES防脫玻片、PBS緩沖液、檸檬酸鹽緩沖鹽、3%H2O2為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 模型制備 對大鼠進(jìn)行21 d應(yīng)激刺激，包括：搖晃5 min，禁水 24 h、禁食 24 h、夾尾 1 min，電擊足底（每次 10 s，間隔1 min），冰水游泳 5 min，噪音刺激、轉(zhuǎn)換晝夜節(jié)律 24 h，制動，熱刺激40℃ 5 min。連續(xù)造模和給藥21 d，每日上午給藥，下午給予相應(yīng)刺激［4］，制得慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁大鼠模型。

1.4 糖水消耗實(shí)驗(yàn) 在造模前1日及造模第22日進(jìn)行糖水消耗實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時所有大鼠均單籠飼養(yǎng)，每只大鼠加1%蔗糖溶液100 mL，同時所有大鼠進(jìn)行禁食，計算大鼠4 h飲用1%蔗糖溶液的量。

1.5 強(qiáng)迫游泳測試 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)在慢性應(yīng)激3周后進(jìn)行（9：30至11：30），把大鼠放在一個盛有高40 cm水（溫度24～26℃）的透明玻璃容器（高25 cm，直徑14 cm）被迫游泳。每只大鼠單獨(dú)測試，按照預(yù)先設(shè)計順序安排各組進(jìn)行游泳測試，保證各組間測試時間無偏倚。在每次測試（6 min）中，記錄后4 min大鼠的不動時間。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 參照《大鼠腦立體定位圖譜》［5］對大鼠海馬組織取材，常規(guī)脫水，浸蠟包埋，切片撈于APES防脫玻片上，60℃烤片4 h，常規(guī)二甲苯脫蠟，過梯度酒精，PBS（0.01 mol/L pH 7.2-7.4） 浸洗 2 min×3，3%H2O210 min，PBS 浸洗 2 min×3，浸入檸檬酸鹽緩沖液（0.01 mol/L pH6.0）微波熱修復(fù)后，滴加一抗 BDNF（濃度為 1∶300），陰性對照組加 0.01 mol／L PBS 代替一抗，4℃冰箱孵育過夜，室溫復(fù)溫30 min后PBS浸洗5 min×3后滴加非生物素二抗，濕盒中室溫30 min，PBS浸洗5 min×3，DAB顯色光鏡下控制時間，常規(guī)脫水，透明，封片。采用Imageproplus5.1圖像分析系統(tǒng)測定每張照片的平均光密度值，每張切片同一部位取五個不同的視野。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以（±s）表示，主要統(tǒng)計學(xué)方法采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠糖水消耗量及強(qiáng)迫游泳不動時間比較 見表1。與正常對照組相比，模型組大鼠糖水消耗量、強(qiáng)迫游泳不動時間顯著減低（P＜0.01）；大劑量舒郁散、百憂解能明顯增加抑郁大鼠糖水消耗量，與模型組比，有顯著差異（P＜0.05）。大劑量舒郁散能明顯縮短抑郁大鼠游泳不動時間，與模型組比，有顯著差異（P＜0.05）；百憂解也能明顯縮短大鼠游泳不動時間，與模型組比有顯著差異（P＜0.05）。

表1 各組大鼠糖水消耗量及強(qiáng)迫游泳不動時間比較（±s）

表1 各組大鼠糖水消耗量及強(qiáng)迫游泳不動時間比較（±s）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

第1日 第22日正常對照組 10 87.74±16.48 88.23±15.42 104.34±16.37模型組 10 85.44±17.16 58.37±12.64*174.26±27.62*百憂解組 10 89.71±15.26 79.46±17.37△ 121.14±21.45△舒郁散大劑量組 10 86.38±16.72 82.87±16.68△ 118.31±19.52△舒郁散小劑量組 10 90.21±14.28 72.62±15.14 146.73±18.66組 別 n 糖水消耗量 強(qiáng)迫游泳不動時間

2.2 各組大鼠海馬BDNF陽性表達(dá)平均光密度值比較 見表2。光鏡下可見BDNF的陽性細(xì)胞主要集中于海馬CA1和CA3區(qū)錐體細(xì)胞和DG顆粒細(xì)胞層。陽性表達(dá)位于海馬神經(jīng)元細(xì)胞胞胞漿中，正常對照組大鼠海馬神經(jīng)元核呈圓形，大而清晰、核仁明顯、排列整齊；模型組海馬中BDNF陽性表達(dá)較正常對照組面積小，胞漿著色淺，平均光密度值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。舒郁散大劑量組、百憂解組大鼠海馬BDNF陽性細(xì)胞表達(dá)比模型組面積更大、顏色更深，兩組平均光密度值與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。舒郁散小劑量組陽性表達(dá)雖有增強(qiáng)，與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 各組大鼠海馬BDNF陽性表達(dá)平均光密度值比較（±s）

表2 各組大鼠海馬BDNF陽性表達(dá)平均光密度值比較（±s）

組 別 n BDNF正常對照組 10 187.28±65.67模型組 10 102.45±47.75*百憂解組 10 168.17±55.38△舒郁散大劑量組 10 173.42±58.74△舒郁散小劑量組 10 156.23±51.49

3 討 論

本課題通過采用慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型，該模型可模擬抑郁癥的核心癥狀，即興趣喪失、快感缺乏、運(yùn)動能力、探索行為能力及性行為能力等下降；其抑郁狀態(tài)持續(xù)時間長符合實(shí)驗(yàn)研究要求。當(dāng)前國外許多學(xué)者采取液體消耗實(shí)驗(yàn)中糖水的消耗量和糖水偏愛百分比作為測量快感缺乏的有效指標(biāo)［6］。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在篩選具有抗抑郁活性的藥物方面發(fā)揮著重要的作用。實(shí)驗(yàn)研究中，造模后大鼠糖水消耗量降低，說明模型組動物活動減少、興趣喪失、食欲減退，而百憂解及舒郁散大劑量可增加慢性應(yīng)激抑郁大鼠糖水的消耗量。通過觀察動物在不可逃避性應(yīng)激狀態(tài)下，因絕望致不動時間的改變可反映藥物的抗抑郁效應(yīng)，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是常用的絕望動物方法［7］，大劑量舒郁散能明顯增加抑郁大鼠糖水消耗量以及強(qiáng)迫游泳不動時間，具有抗抑郁的作用。

BDNF的表達(dá)增加有利于促進(jìn)神經(jīng)元存活、生長和分化成熟，上調(diào)海馬突觸可塑性，被認(rèn)為可能是各種抗抑郁劑治療的共同作用機(jī)制［8］。BDNF主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)大腦內(nèi)，以海馬、皮質(zhì)、屏狀核等腦區(qū)的分布為高，研究表明BDNF對膽堿能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、運(yùn)動神經(jīng)元、γ-氨基丁酸能神經(jīng)元的存活和生長，對延緩神經(jīng)元的變性和自然死亡，均具有很好的生物活性作用；研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者海馬部位及前額葉皮層部位BDNF水平明顯減少［9］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：經(jīng)過21 d慢性應(yīng)激刺激后模型組大鼠海馬組織的BDNF的陽性表達(dá)降低與正常對照組比較差異顯著；中藥大劑量舒郁散和百憂解組夠顯著提高海馬組織BDNF的陽性表達(dá)，這提示舒郁散抗抑郁的藥理可能是通過提高海馬組織BDNF的表達(dá)來起作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Taliaz［10］文獻(xiàn)報道相似。

抑郁癥屬于中醫(yī)學(xué)“郁證”，其發(fā)病大多是由情志所傷，肝失疏泄，肝氣郁結(jié)，氣機(jī)不和所致，病變部位初期在肝，隨著肝郁氣滯、氣機(jī)失和，日久則傷及心、脾二臟，或?yàn)樾幕穑蚋斡舴钙ⅰＲ虼耍委熞钟舭Y實(shí)證以疏肝理氣解郁為主，虛證宜養(yǎng)心健脾安神。本研究采用具有疏肝理氣、養(yǎng)心解郁功效的中藥舒郁散治療，結(jié)果表明大劑量舒郁散可以改善慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為，其作用可能與增加海馬BDNF蛋白表達(dá)有關(guān)，上述作用與其劑量呈正相關(guān)。舒郁散具有調(diào)理心肝、疏肝理氣、養(yǎng)心解郁之功效，本方對治療抑郁癥具有較好的療效，其他文獻(xiàn)也有報道［11-12］。本研究僅觀察舒郁散對慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為、海馬BDNF蛋白表達(dá)變化進(jìn)行研究，抑郁證的發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，有關(guān)舒郁散的作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。

［1］陳利平，孫艷，王發(fā)渭，等.舒郁散對慢性應(yīng)激抑郁大鼠神經(jīng)肽及海馬神經(jīng)元 5-HT 表達(dá)的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，31（1）：113-116.

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