卡馬西平對成年癲癇間大鼠海馬齒狀回Brd U／Neu N表達水平及其對空間記憶的影響

權青云 楊嫣華 李宏圖 李 峰 趙曉娟 林芝惠

癲癇間是一組由大腦神經元異常放電所引起的一組臨床癥狀，對患者及社會造成較大危害，尤其是對患者認知功能的損害。目前國內外研究已證實在成年哺乳動物，包括人類的整個生命過程中海馬齒狀回均有新生的神經元產生［1］。近年不少報道關于癇間性發作誘導的損傷刺激海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）的內源性神經前體細胞的神經發生［2］。抗癲癇間藥是目前控制癲癇間癥狀的最主要的治療方法。雖抗癲癇間藥對癲癇間后海馬DG新生成熟神經元的產生已有報道［3］，但這些新生神經元與認知之間的關系報道較少。本實驗運用氯化鋰和匹羅卡品聯合誘導成年大鼠癲癇間持續狀態（status epilepticus，SE）模型，通過5－溴脫氧尿核苷（5－bromodeoxyuridine，Brd U）標記新生的神經細胞，利用Brd U與神經元核性蛋白（Neu N）雙標記觀察卡馬西平（Carbamazepine，CBZ）對海馬齒狀回內源性神經前體細胞分化為成熟神經元的情況，同時利用行為學分析評價大鼠的空間記憶，為進一步探討卡馬西平對癲癇間患者認知影響提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及藥品 氯化鋰、匹羅卡品、Brd U（5 g／支）均購自sigma公司；大鼠來源抗Brd U單克隆抗體（100 ug／支）購于Santa公司；小鼠來源的Neu N抗體（500 ug／支）購于Chemicon公司；生物素化山羊抗大鼠Ig G抗體、生物素化馬抗山羊IgG抗體、辣根過氧化物酶標記的鏈酶親和素購于sigma公司；Alexa Fluor 594山羊抗大鼠IgG（H＋L）（0.5 ml／支）購于 molecule probe；Alexa Fluor 488猴抗小鼠IgG（H＋L）抗體（0.5 ml／支）購于 molecule probe。

CBZ，商品名：得理多，200 mg／片，北京諾華制藥有限公司，國藥準字H11022279。

行為學分析環境：安靜的測試室，燈光、光線均勻，不透明的塑料測試箱（60 cm×42 cm×37 cm），SONY數碼攝像機，3個尺寸相同，形狀、顏色不同的物體，其中2個完全相同，體積為大鼠體積的1／2～1倍，重量大于大鼠體重。

1.1.2 動物來源及飼養條件 32只Sprague－Dawley（SD）成年雄性大鼠，體重200 g（購自第四軍醫大學實驗動物中心），動物飼養室12 h光－暗循環（6：00－18：00），溫度20～25℃，濕度30～60%，食物和水自由攝取。喂養5 d后開始進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 SE模型制作及分組 腹腔注射氯化鋰（180 mg／kg），20 h后腹腔注射匹羅卡品（30 mg／kg），當大鼠癇間性發作達Ⅳ級或Ⅳ級以上并持續達90 min或抽搐致瀕危時給予腹腔注射苯巴比妥鈉50 mg／kg終止發作［4］。發作級別按 Racine分級［5］，癇間性發作達到Ⅳ級或以上，解除癇間性發作后狀態良好者視為合格SE模型。正常大鼠以相同容積的0.9%氯化鈉取代氯化鋰、匹羅卡品和苯巴比妥鈉。隨機分為4小組（正常對照組，SE組，CBZ組，SE＋CBZ組），每小組各8只大鼠。

1.2.2 藥物用法 于SE后5 h給各大鼠分別灌胃，正常對照組（蒸餾水，1 ml／200 g），CBZ組（CBZ 120 mg·kg－1·d－1，4 mg／ml，1 ml／200 g）［6］，2次／d，8：00－20：00。于SE后第6 d為各大鼠腹腔注射Brd U（50 mg／kg），共2次，間隔2 h。

1.2.3 行為學檢測方法［7］

在處死前3 d各組大鼠每天熟悉適應測試箱45 min，同時熟悉適應空測試盒5 min，連續3 d后進行測試。（1）將每只大鼠置于鋪有墊料的測試盒適應1 min；（2）在測試盒規定的位置放入2個完全相同的物體，觀察大鼠探索物體15 min后（熟悉階段），將大鼠放至動物房；（3）3 h后將大鼠及兩個不同的物體（其中1個是熟悉的物體）同時再次放入測試盒，觀察大鼠探索物體15 min（測試階段）。在測試過程中整個過程被攝像機記錄。觀察每只大鼠探索兩個物體的累計時間及測試階段探索物體前30 s中探索新物體所占比例，并進行分析。大鼠探索物體的主要標準：（1）大鼠的鼻子指向物體的距離必須小于它頭的長度；（2）大鼠探索物體的過程胡須必須運動。排除標準：（1）站在物體上頭向別處張望；（2）身體不經意接觸物體；（3）趴在物體上、靠著物體不動。在下一個大鼠測試前每個物體和測試盒均用75%酒精徹底擦洗。

1.2.4 取材 分別給以各組大鼠戊巴比妥鈉（50 mg／kg）過量麻醉后，打開胸腔，由心尖經二尖瓣至主動脈，0.9%氯化鈉100 ml快速灌注，然后4%多聚甲醛400 ml先快后慢灌注30 min，取腦，4%多聚甲醛后固定2 h，20%蔗糖溶液沉底。冰凍切片機切片，留取海馬部位連續冠狀位切片，片厚30μm，每隔5張取一張腦片為一組收集于0.01M磷酸鉀鹽緩沖 生 理 鹽 水 （potassium phosphate－buffered saline，KPBS）中備用。

1.2.5 免疫熒光染色 取各組大鼠的其中1組腦片，（1）行Brd U變性；（2）加大鼠抗Brd U單克隆抗體（1∶500）及小鼠抗 Neu N 單克隆抗體（1∶200）4℃孵育36 h；（3）避光環境下加山羊抗大鼠（1∶500）及驢抗小鼠（1∶500）熒光二抗室溫下孵育4 h；（4）避光環境下貼片，50%甘油封片，使用日本OLYMPUS X2100共聚焦顯微鏡觀察照相。

2 結 果

2.1 行為學分析 各組大鼠探索兩個物體行為的總時間無明顯差異（P＞0.05）（圖1A）。但是3 h后測試，對照組及CBZ＋SE組大鼠在探索物體的前30 s時間內探索新物體的所占比例明顯高于SE組（P＜0.05）（圖1B）。

2.2 各組大鼠海馬DG區新生神經細胞分化為成熟神經元的情況 日本OlympusBX2100共聚焦顯微鏡下（×400倍）觀察發現，各組大鼠海馬DG區Brd U／NeuN雙陽性細胞主要分布在顆粒細胞層，少數分布在門區，呈單個或兩個，沒有叢集性，細胞核形態比較規則（圖2A）。SE組海馬齒狀回顆粒細胞層Brd U／NeuN雙陽性細胞數較正常對照組明顯減少（P＜0.05），但是SE＋CBZ組Brd U／NeuN雙陽性細胞數量與SE組相比明顯增多（P＜0.05）（圖2B）。

圖1 A 各組大鼠探索物體總時間（s）

圖1 B 各組大鼠探索物體前30 s內探索新物體所占比例

圖2 A 各組大鼠齒狀回新生成熟神經元情況（×400倍）

圖2 B 各組大鼠平均每只大鼠海馬齒狀回Brd U／Neu N＋細胞的數量

3 討 論

本實驗采用氯化鋰－匹羅卡品腹腔注射造模，整個發作過程同人類SE相似。在SE后5 h給大鼠灌胃CBZ，發現CBZ明顯促進新生神經細胞存活，并增加新生成熟神經元產生，與以往研究結果大致一致［8］。同時，從行為學分析發現，CBZ抗癲癇間治療后的SE大鼠空間記憶、學習能力明顯改善。而癲癇間大鼠探索新物體與舊物體的時間各占一半，提示癲癇間大鼠空間記憶能力明顯下降，與以往實驗結果一致［7］。因此，可以推測CBZ較長時間抗癲癇間治療明顯提高新生成熟神經元產生，是CBZ改善癲癇間大鼠的空間記憶、學習能力的實驗室依據之一。

目前AEDs癲癇間藥物是臨床治療癲癇的最主要、最有效手段之一，CBZ為三環類抗驚厥劑，是目前傳統的AEDs之一，臨床應用廣泛，對癲癇間精神運動性發作、大發作、限局性發作及混合性發作均有效。由于癲癇間具有不可預測性、發作性、長期服藥性等特點，不少患者誤認為癲癇間發作只要在發作期控制即可，對生命造成的威脅不大，長期服用較繁瑣，依從性不高。因此，臨床觀察癲癇間患者不正規抗癲癇間治療癲癇間患者均存在不同程度的智能損害，并且越嚴重的癲癇間發作智能損害越嚴重，這在以往的研究中也已證實［9］。本實驗結果顯示，在癲癇間后CBZ干預28 d后發現新生成熟神經元明顯增多，同時行為學研究發現雖然此組大鼠探索物體的累計時間與其他組別無明顯差別，但在探索物體30 s時間內探索新物體所占的時間比例明顯高于SE組，幾乎與正常對照組相同。對于這一現象，本研究推測CBZ可以改善SE大鼠的空間記憶能力。另外，本實驗發現SE組大鼠自發性癲癇間發作頻繁，CBZ干預SE組大鼠在實驗14 d后幾乎無自發性癲癇間發作。這也為臨床上我們發現癲癇間患者長時間服用CBZ，可控制癲癇間發作，并且有助于改善患者智能提供理論依據。

盡管我們發現長時間CBZ抗癲癇間干預治療可以有效控制癲癇間癥狀，增加新生成熟神經元的產生，同時有效改善癲癇間大鼠的空間記憶、學習能力。但這些新生成熟神經元在改善智能方面的作用機制還需進一步研究。正確引導新生神經元發揮正面的、積極的作用將會為癲癇間患者帶來新的希望。

1 Chen J，Cai F，Cao J，et al.Long－term antiepileptic drug administration during early ife inhibits hippocampal neurogenesis in the developing brain.J Neurosci Res，2009，87（13）：2898－2907.

2 Jessberger S，Zhao C，Toni N，et al.Seizure－associated，aberrant neurogenesis in adult rats characterized with retrovirus－mediated cell labeling.Neurosci，2007，27（35）：9400－9407.

3 Jing Chen，Qing Yunguan，Fang Yang，et al.Effects of lamotrigine and topiramate on hippocampal neurogenesis in experimental temporal－lobe epilepsy.Brain research，2010，13（13），270－282.

4 Fang Yang，Jin Cunwang，Jun－Liang Han，et al.Different Effects of Mild and Severe Seizures on Hippocampal Neurogenesis in A－dult Rats.Hippocampus，2008，18（5）：460－468.

5 Kreicbergs A，Tribukait B，Willems J，et al.DNA flow analysis of soft tissue tumors.Cancer，1987，59（1）：128－133.

6 Jari Nissinena，Asla Pitkanen.Effect of antiepileptic drugs on spontaneous seizures in epileptic rats.Epilepsy Research，2007，73（2）：181－191.

7 Jessberger S，Nakashima K，Clemenson Jr GD，et al.Epigenetic Modulation of Seizure－Induced Neurogenesis and Cognitive Decline.J Neurosci，2007，27（22）：5967－5975.

8 權青云，林芝惠，徐曉霞，等.卡馬西平對匹羅卡品誘導成年癲癇間大鼠海馬齒狀回神經發生的影響.卒中與神經疾病，2011，18（2）：78－81，92.

9 李茂林，權青云，林芝惠.不同程度的癇間性發作對成年大鼠空間學習記憶影響的研究.腦與神經疾病雜志，2010，18（2）：148－151.