AtCS25基因過表達載體的構(gòu)建和擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

劉博宇，阮 穎

(湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，長沙410128)

擬南芥作為經(jīng)典的模式植物，是第一個完成全基因組測序的高等植物，隨著研究的不斷深入，越來越多的基因的功能被人們所了解，但是仍然有大量的功能未知的基因等待人們?nèi)ヌ骄俊ｋS著生物信息學、反向遺傳學和現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的不斷進步，這些功能未知基因的定位，以及對于它們的表達與調(diào)控的研究，引起了人們極大的興趣。

在擬南芥大量功能未知的基因里，有很多與花粉和花粉管的發(fā)育相關(guān)。在花粉發(fā)育過程中，涉及近萬種特異表達的基因，但是迄今所發(fā)現(xiàn)的特異基因也不過幾十種。花粉發(fā)育過程中的絕大多數(shù)基因的表達具有時間和空間的特異性，早期基因一般在減數(shù)分裂后被激活;而晚期基因一般在小孢子有絲分裂后表達，另外還有一些基因在植物生長發(fā)育過程中持續(xù)表達。近幾年來，人們在擬南芥中分離了一些花粉發(fā)育特異基因，如花藥絨氈層特異表達基因 A9，AtMLH1，AtDMC1，SYN1，DIF1，在花粉管的伸長期表達的AFH1，在小孢子有絲分裂前表達的AMS和在成熟花粉中特異表達的AVP1，以及一些在花粉發(fā)育晚期表達的基因［1］。

在與花粉發(fā)育相關(guān)的基因中，有一類編碼花粉過敏原蛋白(Pollen allergen)。該蛋白不僅與植物花粉的發(fā)育有關(guān)，在植物整個生長發(fā)育過程中也起著重要的作用。花粉過敏原的分子大小從8 kD至50 kD不等，他們的特點表現(xiàn)為可溶，并且較穩(wěn)定。到今天為止，已經(jīng)有報道的花粉過敏原家族有10余類［2］。AtCS25屬于花粉過敏原家族。

Profilin，BetvⅠ和BetvⅢ是白樺花粉的3種主要過敏原。Profilin的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為800 nt，推測蛋白為266 aa，該蛋白不僅在花粉中有表達，同時在植物其他器官中也有微量的表達。BetvⅠ編碼一個長度為160 aa蛋白質(zhì)，而BetvⅢ包含203個氨基酸，它們都屬于Ca2+結(jié)合蛋白，特異表達于成熟花粉中，并參與花粉管的萌發(fā)和生長［3，4］。豚草花粉的主要過敏原是AmbaI，其分子量大小為38 kD，在其N端存在一個疏水區(qū)信號肽序列，是一種可溶性蛋白。AmbaI基因家族的同源性非常高，轉(zhuǎn)錄的mRNA都在1 500 nt左右［3］。研究人員從黑麥草(ryegrass)花粉cDNA文庫中篩選得到了兩個糖蛋白過敏原基因，分別為LolpIa和LolpIb。LolpIa基因在花粉細胞中表達，編碼的蛋白質(zhì)大小為35 kD，其N端23個氨基酸為信號肽。LolpIb所編碼的蛋白質(zhì)大小為31 kD，其主要存在于淀粉粒中，信息學分析表明其N端25個氨基酸與葉綠體轉(zhuǎn)運肽相似［3］。

Ole_e_1是第一個從橄欖樹花粉中分離并純化的花粉過敏原蛋白［5］。該蛋白由一條含有145個氨基酸的單肽鏈構(gòu)成，它與番茄中LAT52基因和玉米花粉中Zmc13基因編碼的蛋白具有相似性［6］。Ole結(jié)構(gòu)域包含6個保守的半胱氨酸，這可能與二硫鍵的形成有關(guān)。同時該結(jié)構(gòu)域還包含有一致的序列E/Q/T－G－X－V－Y－C－D－T/N/P－C－R(X代表任何氨基酸)［2］。有一些富含脯氨酸并且含有Ole結(jié)構(gòu)域的蛋白編碼類伸展蛋白［7］。至今已從橄欖樹花粉中分離并證實了10種含有Ole結(jié)構(gòu)域的蛋白。人們在水稻中的研究表明，編碼含有Ole結(jié)構(gòu)域的蛋白的基因在水稻的各個部位都有表達，說明花粉過敏原基因不僅在植物生殖生長中起作用，在植物的營養(yǎng)生長中也起到了很重要的作用［2］。

盡管對花粉過敏原蛋白的研究已取得一定的進展，但是在擬南芥中對該類蛋白的了解還很少，尤其是它們的功能。本文對擬南芥AtCS25基因做了生物信息學分析，以及過表達分析，以為繼續(xù)深入探究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型Col，由湖南農(nóng)業(yè)大學植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控實驗室保存。

1.2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌 (Escherichia coli)DH5α，農(nóng)桿菌GV3101和pBI121過表達載體由湖南農(nóng)業(yè)大學植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控實驗室保存;pMD－19購自TAKARA公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學分析

在TAIR上下載AtCS25基因的全長CDS序列，利用DNA Star軟件將其翻譯成蛋白序列，然后將翻譯后的蛋白序列輸入到NCBI上進行保守結(jié)構(gòu)域分析。利用在線跨膜結(jié)構(gòu)分析軟件TMHMM Server v 2.0分析該蛋白是否存在跨膜結(jié)構(gòu)，再通過在線亞細胞定位分析軟件TargetP 1.1 serve來推測該蛋白在細胞內(nèi)的定位。

1.3.2 引物設(shè)計以及AtCS25基因全長CDS片段的克隆

由于園林花卉相對于人工培育花卉具有更強的生命力，因此在我國的園林綠化中應用非常廣泛。園林綠化使用花卉時，要考慮各方面因素，選擇適宜的花卉種類，并采取科學合理的栽培方法，加強后期養(yǎng)護管理，提高花卉成活率。

根據(jù)網(wǎng)站 TAIR上公布的序列，采用 Primer Premier 5引物設(shè)計軟件設(shè)計了一對引物AtCS25－F/R，用來擴增AtCS25基因的全長CDS。并根據(jù)載體pBI121的特點，在引物的5'端分別加上Xbal和BamH1位點，引物序列為:

AtCS25－F:5'－TCTAGA ATGGCATCCACAG GCGCCG －3'(Xbal)，

AtCS25－R:5'－GGATCCCTAGTAAACGGGT TTGGGAGCC－3'(BamH1)

擴增產(chǎn)物大小為567 bp。以擬南芥Col生態(tài)型為材料，采用Trizol法提取擬南芥葉片總RNA。根據(jù)Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，將得到的 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以擬南芥Col生態(tài)型葉片cDNA為模板，用AtCS25－F/R引物擴增AtCS25基因的全長CDS。PCR反應采用NEB公司的LongAmp Taq高保真酶進行擴增，退火溫度為60℃，循環(huán)28次。將PCR產(chǎn)物連接到 pMD19－T載體上，構(gòu)成 pMD19－T－AtCS25載體，通過熱激法將此載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，挑選陽性克隆送博尚生物公司測序。

1.3.3 AtCS25基因表達載體的構(gòu)建

用Xbal和BamH1限制性內(nèi)切酶分別對pMD19－T－AtCS25和pBI121載體進行雙酶切，通過膠回收試劑盒將目的片段和載體片段分別回收，采用 Fermentas公司的快速 T4連接試劑盒，將AtCS25基因全長CDS連接至pBI121載體相對應的位置，構(gòu)建成pBI121－AtCS25過表達載體。

通過凍融法將構(gòu)建好的AtCS25基因過表達載體pBI121－AtCS25轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，挑取陽性克隆后進行PCR驗證。采用浸花法將pBI121－AtCS25載體轉(zhuǎn)化擬南芥Col生態(tài)型，并獲得轉(zhuǎn)基因植株。

1.3.5 擬南芥轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定

將收獲的T0代種子鋪在含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，卡那霉素濃度為40 mg/mL，待植株生長15 d后，將具有抗性的植株從MS培養(yǎng)基上移栽至土壤中。為了檢測目的片段是否已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)化子的基因組上，根據(jù)pBI121－AtCS25載體序列信息，設(shè)計檢測引物121JC－F:5'－TTCGCAAGACCCTTC CTCTATATAA －3'，121JC －R:5'－AGCTCGACCAG GATGGGCAC－3'。提取抗性植株的總 DNA，用該對引物進行PCR檢測，鑒定轉(zhuǎn)化子。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學分析結(jié)果

將AtCS25氨基酸序列輸入到NCBI網(wǎng)站中分析，結(jié)果表明，在其第57至151位氨基酸構(gòu)成一個Pollen_Ole_e_1(Ole)結(jié)構(gòu)域(圖1)。

圖1 結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Domain analysis

用在線分析軟件TMHMM 2.0分析AtCS25氨基酸序列，結(jié)果顯示在第7至26位氨基酸處存在一個跨膜結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖2 跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Transmembrane structure analysis

使用亞細胞定位分析軟件TargetP1.1對AtCS25氨基酸序列進行分析表明，該蛋白很有可能是一種分泌蛋白，可能定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(圖3)。

圖3 亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization

2.2 目的片段的克隆與分析

通過梯度PCR確定了引物AtCS25－F/R最適退火溫度為 61℃。PCR擴增 AtCS25基因全長CDS，得到了約567 bp大小的條帶(圖4)，其大小與預期的結(jié)果一致。將得到的目的片段切膠回收，然后連接到pMD19－T載體上，通過熱激法將連接后的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，選取陽性克隆送公司測序，將測序結(jié)果與網(wǎng)站上公布的序列進行比對，其同源性為100%。表明克隆結(jié)果正確，可以用于下一步實驗。

圖4 AtCS25基因的克隆Fig.4 Clone of AtCS25 gene

2.3 重組質(zhì)粒的酶切驗證

挑取轉(zhuǎn)化菌落，提取重組質(zhì)粒 pBI121－AtCS25，用 Xbal和 BamH1雙酶切 pBI121－AtCS25，得到一條約567 bp的條帶(圖5)，表明pBI121－AtCS25載體已經(jīng)構(gòu)建成功。

圖5 重組質(zhì)粒的酶切驗證Fig.5 Identification of recombinant vector by restriction enzyme digestion

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得和鑒定

一共從含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上篩選出抗性苗5株，用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株和未經(jīng)轉(zhuǎn)化的Col野生型葉片的總 DNA，用載體檢測引物121JC－F/121JC－R對其進行擴增，結(jié)果如圖6。電泳結(jié)果顯示，Col野生型沒有出現(xiàn)條帶，1～5號泳道條帶大小與7號泳道質(zhì)粒對照擴增出的片段一致，證明獲得了5株轉(zhuǎn)基因苗。

圖6 抗性植株的PCR檢測Fig.6 PCR identification of transgenic plants with kanamycin－resistance1～5.抗性苗;6.陰性對照;7.陽性對照

2.5 轉(zhuǎn)基因植株過表達分析

提取Col野生型和抗性植株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到 cDNA，用 AtCS25基因的表達檢測擴增cDNA，結(jié)果如圖7所示。AtCS25基因在Col野生型中的表達量明顯低于其他5株轉(zhuǎn)基因植株，表明AtCS25基因在CaMV35S強啟動子的驅(qū)動下得到了過表達。轉(zhuǎn)基因植株在個體上比野生型略微大一些，莖稈稍粗，花在形態(tài)上也比野生型略大，說明該基因不僅與花粉的發(fā)育相關(guān)，還可能在植株整個發(fā)育過程中起作用。

圖7 AtCS25基因表達水平的RT－PCR分析Fig.7 RT－PCR analysis of AtCS25 overexpression

3 小結(jié)與討論

對編碼包含Ole結(jié)構(gòu)域的基因的研究最初是在番茄和玉米中進行的［9，10］，而在橄欖樹花粉中分離得到的一些花粉過敏原蛋白，被認為是主要的過敏原物質(zhì)。到目前為止，在不同的植物中共鑒定出數(shù)百個編碼Ole結(jié)構(gòu)域的基因。通過生物信息學分析，以及分子生物學的方法，研究人員在水稻中鑒定了114個花粉過敏原基因［2］，這說明借助生物信息學以及公共的數(shù)據(jù)庫資源來推測并鑒定新基因的方式變得尤為重要。盡管如此，只有少數(shù)基因的功能得到了驗證，包括花粉特異表達基因Zmc13和在雌蕊中特異表達的基因 LAT52［7］。

本研究通過生物信息學分析，以及基因過表達的方法，對擬南芥中包含Ole結(jié)構(gòu)域的功能未知基因進行了初步的探究。結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白屬于花粉過敏原蛋白家族，具有跨膜結(jié)構(gòu)，并很可能為一種分泌蛋白，推測該基因不僅與植物花粉的發(fā)育有關(guān)，也可能在植物營養(yǎng)生長過程中起著重要的作用。過表達植株與野生型植株表型相似，該基因的過量表達對植株生長發(fā)育具體有哪些影響有待進一步的研究。

［1］劉樂承，張 弢，曹家樹.植物花粉發(fā)育的分子生物學研究進展［J］.長江大學學報，2006，3(3):174－177.

［2］Jiang SY，Jasmin XH，Ting YY，et al.Genome－ wide identication and molecular characterization of Ole_e_I，Allerg_1 and Allerg_2 domain－containing pollen－allergen－ like genesin Oryza sativa［J］.DNA Research，2005，12:167 –179.

［3］Mascarenhas JP.Pollen gene expression:molecular evidence［J］.International Review of Cytology，1992，140:3－17.

［4］Susanne Seiberler，Otto Scheiner，Dietrich Kraft，et al.Characterization of a birch pollen allergen，Bet v Ill，representing a novel class of Ca2+binding proteins;specific expression in mature pollen and dependence of patients’IgE binding on protein － bound Ca2+［J］.EMBO J，1994，13:3481－ 3486.

［5］Marsh DG，Goodfriend L，King TP，et al.Allergen nomenclature［J］.Bull World Health Organ，1986，64:767–774.

［6］De Dios Alche J，M’rani－Alaoui M，Castro AJ，et al.Ole e 1，the major allergen from Olive(Olea europaea L.)pollen，increases its expression and is released to the culture medium during in vitro germination［J］.Plant Cell Physiol，2004，45:1149 –1157.

［7］Goldman MH，Pezzotti M，Seurinck J，et al.Developmental expression of tobacco pistil－specific genes encoding novel extensin － like proteins［J］.Plant Cell，1992，4:1041–1051.

［8］宋江華，張立新.植物花粉發(fā)育的基因工程研究進展［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)科學，2008，24(12):23–26.

［9］Hanson DD，Hamilton DA，Travis JL，et al.Characterization of a pollen－specific cDNA clone from Zea mays and its expression［J］.Plant Cell，1989，1:173 –179.

［10］Muschietti J，Dircks L，Vancanneyt G，et al.LAT52 protein is essential for tomato pollen development:pollen expressing antisense LAT52 RNA hydrates and germinates abnormally and cannot achieve fertilization［J］.Plant J，1994，6:321–338.