高糖對小鼠足細胞表型轉化的誘導作用及機制探討

劉青娟，張玉軍，李建英，付曉輝，姚 芳，吳海江，邢玲玲

(1河北醫科大學病理教研室，石家莊050017;2石家莊市人民醫院;3河北醫科大學第二醫院)

近年研究顯示，糖尿病腎病(DN)時高糖環境、糖基化終產物、血管內皮生長因子、氧自由基、轉化生長因子-β、血管緊張素Ⅱ和機械應力的增加都可以損傷足細胞，而足細胞的損傷與蛋白尿的產生關系密切，在DN發生發展中起關鍵作用［1～4］。有研究［5，6］顯示，與腎近端小管上皮細胞類似，足細胞亦可在病理因素刺激下發生表型轉化，即上皮向間充質細胞轉分化(EMT)，從而脫離基底膜，導致腎小球濾過屏障發生障礙引起蛋白尿，但有關足細胞表型轉化機制的研究較少。近年來，我們的實驗研究結果表明，在糖尿病動物及高糖培養的系膜細胞、腎小管上皮細胞中，JAK/STAT信號通路的活性明顯增強，且該通路的激活與腎小管上皮細胞表型轉化有關。由此我們推測，高糖誘導的足細胞表型轉化或許也與JAK/STAT通路有關。2010年9月～2011年10月，我們應用蛋白質酪氨酸激酶(JAK2)的特異性阻斷劑 α-氰-(3，4-二羥基)-N-芐基肉桂酰胺(AG490)干預足細胞，觀察足細胞自身標志物人腎病蛋白(Nephrin)和間充質細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的變化，探討高糖誘導足細胞表型轉化的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠足細胞株購自中國協和醫科大學細胞中心;兔抗Nephrin、α-SMA、β-actin多克隆抗體購自北京博奧森公司，兔抗p-JAK2抗體購自Santa Cruz公司;AG490購自美國Calbiochem公司;逆轉錄—聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑為Promega公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 將凍存的足細胞復蘇后，置于含 10 U/mL γ-干擾素和 10%胎牛血清的DMEM-F12培養基中，33℃細胞培養箱中培養;傳代后轉入不含γ-干擾素的培養基中37℃培養10～14 d，使足細胞充分分化后進行后續實驗。實驗前換無血清培養基孵育12 h，使細胞同步化。將細胞隨機分為A、B、C三組，A組常規培養不處理，B組加入終濃度為30 mmol/L的葡萄糖，C組加入終濃度為30 mmol/L的葡萄糖及10 μmol/L的 AG490。

1.2.2 足細胞中Nephrin、α-SMA和p-JAK2蛋白的檢測 采用Western blot法。培養48 h后收集細胞，加入蛋白裂解液提取蛋白，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，－70℃保存。每個樣品取50 μg總蛋白，10%SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至PVDF膜;5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，再分別加入兔抗p-JAK2、α-SMA 多克隆抗體(1∶500稀釋)，4 ℃過夜。ECL化學發光法顯色，以 β-actin作為內參照。Western blot條帶信號強度采用Lab Work 45圖像分析軟件進行定量分析，測定各條帶的積分光密度值(IOD)，以此表示目標蛋白的表達量。

1.2.3 足細胞中 Nephrin、α-SMA mRNA 的檢測采用RT-PCR法。Trizol法提取細胞總RNA，用紫外分光光度儀測定其濃度后，在逆轉錄酶作用下合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。18 S rRNA的上下游引物分別為5'-ACA CGG ACA GGA TTG ACA GA-3'、5'-GGA CAT CTA AGG GCA TCA CAG-3'(238 bp)，α-SMA的上下游引物分別為5'-CTG AAG AGC ATC CGA CAC-3'、5'-GAC TCC ATC CCA ATG AAA G-3'(520 bp)，Nephrin的上下游引物分別為 5'-CCC CAA CAT CGA CTT CAC TT-3'、5'-GGC AGG ACA TCC ATG TAG AG-3'(372 bp)。所用引物均由上海捷銳生物公司合成。將PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后置于凝膠圖像分析系統(UVP公司，美國)進行吸光度掃描，以18 S rRNA作為內參照校正，用目的基因的吸光度與18 S rRNA吸光度的比值代表目的基因的相對表達量。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。所得數據以±s表示，多組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組足細胞中 Nephrin、α-SMA、p-JAK2 蛋白的表達量比較 見表1。

表1 各組足細胞中Nephrin、α-SMA、p-JAK2蛋白表達量比較(±s)

表1 各組足細胞中Nephrin、α-SMA、p-JAK2蛋白表達量比較(±s)

注:與 A組比較，*P ＜0.05;與 B 組比較，#P ＜0.05

組別 Nephrin α-SMA p-JAK2 A組0.96±0.01 0.21±0.02 0.39±0.01 B 組 0.58±0.01* 0.66±0.07* 0.71±0.02*C 組 0.87±0.04# 0.35±0.02# 0.41±0.04#

2.2 各組足細胞中Nephrin、α-SMA mRNA的表達量比較 見表2。

表2 各組足細胞中Nephrin、α-SMA mRNA相對表達量比較(±s)

表2 各組足細胞中Nephrin、α-SMA mRNA相對表達量比較(±s)

注:與 A組比較，*P ＜0.05;與 B 組比較，#P ＜0.05

組別 Nephrin mRNA α-SMA mRNA A組1.53±0.04 0.57±0.01 B 組 0.82±0.09* 0.89±0.03*C 組 1.30±0.04# 0.78±0.03#

3 討論

腎臟纖維化是各種慢性腎臟疾病的最終結局，隨著糖尿病發病率的上升，DN逐漸成為導致終末期腎病的主要原因之一。肌成纖維細胞是細胞外基質的主要來源，在腎臟纖維化中發揮著至關重要的作用。正常腎組織中幾乎無肌成纖維細胞。大量實驗研究表明，EMT是肌成纖維細胞的主要來源。以往的研究更關注腎小管上皮細胞的轉分化，而足細胞和腎小管上皮細胞均來源于胚胎中胚層的間葉細胞，因此考慮足細胞和小管上皮細胞一樣，在病理條件下具有轉分化為間葉細胞的可能性［1］。

近年來，越來越多的研究［5～8］表明，在某些病理因素作用下，腎小球足細胞確實也可發生EMT，即喪失其特異性標志物，表現出轉分化的特征，從而在腎小球濾過屏障受損、蛋白尿及腎小球硬化過程中發揮重要作用。DN發病過程中伴隨有明顯的足細胞形態和功能異常，考慮足細胞EMT是其中的關鍵病理過程［6］。α-SMA是普遍公認的一種提示上皮細胞發生EMT的標志性蛋白之一。在生理條件下，足細胞不表達α-SMA，其在足細胞中的表達可作為足細胞發生EMT的一個有價值的指標。本研究結果顯示，與A組相比，B組在高糖刺激下可使足細胞Nephrin的表達減少而α-SMA表達增加，提示高糖可誘導足細胞發生表型轉化。

足細胞轉分化后可獲得分泌功能，使細胞外基質分泌過多，從而導致腎小球硬化并最終發展至纖維化［9］。逆轉足細胞功能損傷可延緩或減輕DN的進展［10］。因此，探討足細胞轉化的機制，并進一步阻斷該過程至關重要。JAK/STAT信號通路是細胞因子信號轉導的重要通路之一。JAKs家族是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，STATs是JAKs激酶的底物，磷酸化的STATs以二聚體的形式存在并轉移到核內調控基因表達。以往對腎小管上皮細胞轉化的研究［11，12］表明，JAK/STAT 信號通路在高糖、細胞因子等多種刺激因素誘導上皮轉化中均發揮重要作用。由此，我們考慮JAK/STAT信號通路可能也參與了高糖誘導的足細胞轉分化。為了驗證這一觀點，我們首先檢測了高糖刺激后足細胞中p-JAK2和p-STAT1的表達，證實高糖可以激活足細胞中的JAK/STAT信號通路。之后我們在高糖誘導足細胞轉化的同時采用AG490進行干預，結果發現，與單純高糖刺激相比，同時加入AG490干預后，在抑制JAK/STAT通路的同時，足細胞中α-SMA蛋白及其mRNA表達明顯降低。提示AG490可通過阻斷JAK/STAT信號通路抑制高糖誘導的足細胞表型轉化。本研究結果為DN蛋白尿的防治提供了實驗依據。

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