康腦液對腦缺血大鼠5-溴脫氧尿嘧啶核苷及巢蛋白表達的影響

耿 倩，馬 倩，鄒玉安，薛 茜

(1河北北方學院，河北張家口075000;2河北北方學院第一附屬醫院)

在中國，腦卒中是僅次于癌癥的第2位殺手，是威脅中老年人生命健康的常見神經系統疾病，其中缺血性腦血管病(ICVD)占56.6% ～80%，患者總人數達500萬 ～600萬，存活者致殘率最高達約75%［1］。ICVD的防治已成為目前研究重點。2011年4月，我們觀察了康腦液對腦缺血再灌注大鼠內源性神經干細胞(NSC)增殖的影響，旨在為康腦液防治ICVD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 ①實驗動物:健康雄性SD大鼠120只，體質量200～270 g，SPF/UAF級，購自北京大學醫學部實驗動物科學部［許可證號SCXK(京)2006-0008］。②藥品及試劑:康腦液飲片(河北北方學院第一附屬醫院)，冷水浸泡一夜，煎煮2次，濾出藥渣，將2次煎煮的藥液混勻，文火分別濃縮成400%、200%、100%康腦液(每毫升分別含生藥4、2、1 g)，置4℃冰箱保存備用;5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU，南京探求生物技術有限公司)粉劑(按10 mg/mL溶解于生理鹽水中)，兔抗鼠巢蛋白(Nestin)抗體(鎮江厚普生物科技公司)，鼠抗尿嘧啶脫氧核苷單克隆抗體(北京中山生物技術公司)。③實驗儀器:電腦生物組織包埋機(浙江金華科迪儀器公司)，石蠟切片機(美國Thermo)，電腦生物組織攤片烤片機(浙江金華科迪儀器公司)，光學顯微鏡(日本OLYMPUS BX60型)，顯微攝影裝置(日本 NIKON)。

1.2 動物分組及處理 將120只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組及康腦液高、中、低劑量組，每組24只。五組均于術前7 d開始灌胃，其中康腦液高、中、低劑量組分別予24、12、6 g/(kg·d)康腦液，假手術組及模型組給予等量蒸餾水，1次/d、直至處死。模型組及康腦液各組均根據Longa等研究，以線栓經右側頸外動脈插線法建立右側大腦中動脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，假手術組僅切開動脈、不阻斷。術后24 h五組均開始腹腔注射BrdU溶液50 mg/kg，1次/d、直至處死。

1.3 腦組織取材及BrdU、Nestin表達檢測 ①腦組織取材:分別于缺血2 h再灌注后3、7、14、21 d各取6只處死取材:腹腔注射10%水合氯醛麻醉，經左心室插管至升主動脈，灌注肝素化生理鹽水300 mL，4%多聚甲醛灌注固定30 min，快速斷頭取腦，以視交叉為中線將腦組織切成厚度2～3 mm的組織塊，4%多聚甲醛液固定，常規石蠟切片，切片厚度為3μm。②BrdU、Nestin表達檢測:采用免疫組化SP法。按照說明書操作，80℃烤片120 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min;微波中火，0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH值為6.0)修復10 min，自然冷卻至室溫;3%H2O2室溫孵育10 min;正常山羊血清工作液封閉，室溫孵育15 min，傾去、勿洗;滴加一抗(工作濃度為 1∶100)、4℃過夜，滴加生物素化二抗、37℃孵育15 min，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液、37℃孵育15 min;DAB顯色，顯微鏡觀察染色結果，以細胞呈棕黃色為陽性信號。每只大鼠取相同部位的切片各3張，每張切片在鏡下(×400)隨機選取缺血側5個非重疊視野，計算陽性細胞數均值(陽性細胞數目/400倍視野)。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計學處理。計量數據以ˉx±s表示，組內比較用方差分析，組間比較行t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

假手術組大腦皮質、海馬部位有少量 BrdU、Nestin陽性細胞;余四組再灌注7 d時BrdU、Nestin陽性細胞開始增多，14 d達高峰、21 d開始下降，但各時間點均顯著高于假手術組(P＜0.05或0.01);與模型組比較，康腦液各組BrdU陽性細胞數量在再灌注后各時間點均顯著升高(P＜0.05或0.01)，Nestin陽性細胞數量在再灌注后第7、14、21天均顯著升高 (P ＜0.05)，見表1、2 及圖1、2。

3 討論

表1 五組腦缺血再灌注后各時間點Brd U陽性細胞數比較(n=24，個，ˉx±s)

表2 五組腦缺血再灌注后各時間點Nestin陽性細胞數比較(n=24，個，ˉx±s)

圖1 五組腦缺血再灌注后14 d缺血側皮質Brdu表達(×400)

圖2 五組腦缺血再灌注后14 d缺血側皮質Nestin表達(×400)

自Eriksson等發現成年人腦中存在神經元發生現象后，成年人腦神經元不能再生的理論即被打破。眾多研究表明，成年哺乳動物內源性NSC處于靜止狀態，改變內環境能激發靜止狀態的NSC并誘導其增殖、向病灶遷移，進而定向分化為成熟神經元以替代受損或缺失的神經元，實現自我修復。因此，利用神經細胞因子或藥物等增強腦內源性NSC自我更替和修復能力可能是一種新的腦部疾病治療途徑，為ICVD的治療提供了新的思路。中醫認為，腦卒中發生主要是由于氣虛血瘀所致，治療原則以益氣活血化瘀為主。目前研究發現，黃芪［2］、川芎［3］等單味中藥的某些成分和復方芪棱湯［4］、通心絡［5］、補陽還五湯［6］等均能促進神經再生。康腦液為臨床經驗方，由益氣活血的鼻祖方補陽還五湯按照現代人的特點化裁而來，由黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤、三七等組成，臨床用于治療ICVD具有較好療效。

BrdU是一種胸腺嘧啶核苷的類似物，NSC發生分裂增殖后可作為底物參與DNA合成，被視為細胞增殖的標記。已有研究表明，腦缺血可促進大腦皮質、海馬等處 NSC 增殖、遷移和分化［7～9］，且 NSC 增殖也有一定規律性，即神經再生并不是在腦缺血后短期內增強的，其再生能力在第10天左右達到峰值［10］。Nestin是NSC內一種特殊的中間絲蛋白，被視為其特異性標記蛋白［11，12］，其C末端大量的絲氨酸可能是磷酸化位點，絲氨酸的磷酸化可能影響Nestin與其他細胞骨架的結合。因此，Nestin很可能是一種自我保護性蛋白，有利于細胞存活及細胞骨架的穩重和重建，其重新表達在缺血腦周圍可能增加腦組織的抗缺血能力，從而有利于神經系統功能的恢復。本研究顯示，假手術組大腦皮質、海馬部位有少量BrdU、Nestin陽性細胞;余四組再灌注7 d時BrdU、Nestin陽性細胞開始增多，14 d達高峰、21 d開始下降，但各時間點均顯著高于假手術組;與模型組比較，康腦液各組BrdU陽性細胞數量在再灌注后各時間點均顯著升高，Nestin陽性細胞數量在再灌注后第7、14、21 d顯著升高。提示康腦液可通過上調BrdU、Nestin表達促進腦缺血損傷后內源性NSC增殖，此為其治療ICVD的重要機制之一;但上調的確切機制尚不清楚，有待于進一步研究。

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