原發性免疫缺陷病患者B淋巴母細胞系的建立及其核型檢測

姜昱竹，胡雪梅，邢建琴，王躍嗣，劉現兵，郭春鳳

(1濱州醫學院煙臺校區，山東煙臺264003;2威海市文登中心醫院)

原發性免疫缺陷病(PIDD)是由于免疫系統遺傳基因異常或先天性免疫系統發育障礙而致免疫功能不全引起的罕見疾病，多發生于嬰幼兒。患兒除表現為免疫功能缺損外，尚可伴有其他組織器官的發育不全或畸形，可導致患兒夭折［1］。近年研究表明，PIDD多數具有明顯的遺傳傾向［2］。2011年3月，我們采用EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)轉化PIDD患者外周血B淋巴細胞建立B淋巴母細胞系(B lymphoblastoid cell line，B-LCL)，旨在為進一步開展PIDD的遺傳學和分子生物學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 B95-8細胞株(本實驗室保存)，RPMI1640培養基(HyClone公司)，胎牛血清(HyClone公司)，環孢菌素 A(Cyclosporin A，CsA，Sigma公司)，Ficoll淋巴細胞分離液(天津TBD生物技術有限公司)，PIDD患者外周血(濱州醫學院附屬醫院)。

1.2 實驗方法

1.2.1 EBV懸液的制備 將B95-8細胞密度調整為1×106/mL，接種于10 mL含10%胎牛血清的完全RPMI1640培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。每2～3 d半量換液1次，逐漸增加培養基到所需體積，之后不再更換和補充培養基，至培養物變為黃色。收集細胞懸液于－70℃及37℃反復凍融3次，2 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾，分裝后－70℃保存備用。

1.2.2 外周血單個核細胞(PBMCs)分離 無菌采集PIDD患者外周肝素抗凝血6 mL，PBS等量稀釋后沿管壁緩慢加于8 mL淋巴細胞分離液上，2 000 r/min離心15 min，小心吸出含有PBMCs的中間層將其轉移至另一離心管中，PBS洗滌2次，收集細胞備用。

1.2.3 EBV轉化B-LCL的建立 用3 mL含20%胎牛血清的完全RPMI1640培養基重懸上述PBMCs，加入EBV懸液1 mL，CsA 80μL(終質量濃度為2μg/mL)，混勻后轉入T25培養瓶，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。7 d左右鏡下觀察，根據細胞轉化和增殖情況半量換液;待細胞較多聚團生長時傳代至T75培養瓶中，繼續培養、換液和傳代;3～4周可獲得穩定的B-LCL。

1.2.4 B-LCL的凍存與復蘇 預先配制細胞凍存液(95%胎牛血清+5%二甲基亞砜)，按每管5×106個細胞加入1.5 mL凍存液，放入預冷的梯度降溫細胞凍存盒中，－80℃過夜，次日移入液氮中長期保存。復蘇時將細胞凍存管迅速置于37℃水浴箱融化，離心去上清，以含20%胎牛血清的完全RPMI1640培養基重懸細胞后移入培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2.5 B-LCL的核型檢測 取 PBMCs和轉化后細胞B-LCL分別加新鮮培養液培養18～24 h，充分吹散細胞團，加秋水仙素37℃放置2 h，1 500 r/min離心10 min，棄上清;以KCl溶液(0.075 mol/L)8 mL重懸沉淀，37℃放置30 min;加入甲醇/冰醋酸1 mL，輕輕吹打混勻，離心棄上清;加入甲醇/冰醋酸10 mL輕輕重懸沉淀，室溫放置30 min，離心棄上清;重復甲醇/冰醋酸固定2次，離心后剩余1 mL液體重懸沉淀;常規法制片;晾干后Giemsa染色觀察。

2 結果

2.1 B-LCL的形態學特征 接種后7 d左右倒置顯微鏡顯示，細胞形態呈淋巴母細胞樣改變，細胞體積明顯增大，呈圓形或橢圓形，胞質豐富(圖1A);約2周開始形成肉眼可見、大小不等的白色細胞克隆(圖1B);之后隨細胞分裂增生，細胞數量不斷增多，細胞克隆不斷增大，呈懸浮或半貼壁生長(圖1C)，高倍鏡下可見細胞克隆邊緣有毛刺狀突起。

圖 1 EBV 轉化 7 d(A)、14 d(B)、21 d(C)B淋巴母細胞的形態(100×)

2.2 B-LCL的凍存、復蘇與擴增 細胞在液氮中保存4周后復蘇活性良好，臺盼藍染色顯示細胞活性＞90%。復蘇后3 d即可傳代，鏡下觀察細胞形態正常。建立的B-LCL細胞系可連續傳代培養4個月以上。

2.3 B-LCL的核型 PBMCs和轉化后細胞B-LCL染色體的核型分析未見異常。

3 討論

自1952年Bruton發現首例PIDD以來，迄今為止已發現160多種PIDD［3］。PIDD發病年齡早，臨床以感染為主要特征，可嚴重影響患兒的生活質量，并造成高致殘率和高致死率［1］。盡管其病因尚未完全清楚，但目前已發現百余種與PIDD相關的基因異常［2］。外周血淋巴細胞是細胞遺傳學和分子遺傳學研究最常用的標本，然而其壽命有限，給進一步的研究工作帶來許多不便。EBV是一種普遍存在的人類皰疹病毒，在體外能夠高效率感染靜止的B淋巴細胞，使其成為連續分裂、永久生存的BLCL，是在體外獲得無限量B淋巴細胞及保存遺傳信息的有效手段［4］。EBV基因組可以500～800拷貝存在于宿主細胞中，對其基因組 DNA多無影響［5］。因此，永生化B-LCL可保存提供血樣個體的完整基因組，且其生化和分子生物學特性不發生變化［6］。此外，EBV在體外對B淋巴細胞的轉化效率很高，一般能達到80% ～100%。近年來，國內外實驗室普遍采用EBV感染外周血來建立人類遺傳種質庫。目前為止，本實驗室共建成PIDD患者外周血永生化 B-LCL細胞株 16例，建株成功率為100%。

正常人群中約90%以上個體在兒童時期曾感染過EBV，其形成的抗EBV免疫功能可持續終身。體外建系時，EBV特異性的記憶T淋巴細胞接觸病毒后可被激活，對EBV轉化的B淋巴細胞產生特異的細胞毒作用［7］，使得形成的淋巴母細胞克隆很快退化;另外CD+4T淋巴細胞也可通過CD95和CD95配體介導轉化B淋巴母細胞的凋亡［8］，使B淋巴細胞不能轉化或其轉化的增殖灶在1～2周迅速退化，致使建系失敗。因此，抑制或去除外周血中T淋巴細胞的活性是建立B-LCL的關鍵。CsA是一種高效免疫抑制劑，能夠在G0、G1期選擇性抑制T淋巴細胞RNA聚合酶Ⅱ的活性［9］，使T淋巴細胞失去對EBV的免疫反應，從而有效防止已轉化的B淋巴母細胞退化，使B-LCL的建系和增殖得以成功。本實驗即采用EBV感染加CsA轉化的方法建系，結果顯示轉化后細胞的體積明顯增大，呈母細胞化，聚集成團，懸浮或半貼壁生長;能夠成功凍存、復蘇及傳代;且轉化后細胞的染色體核型與PBMCs比較無明顯差異。表明PIDD患者永生化的B-LCL成功建立，且轉化后細胞核型穩定，保留了原有的遺傳標志。

綜上所述，本實驗成功建立了PIDD患者永生化的B-LCL，為進一步開展PIDD的病因學研究及診斷、治療奠定了基礎。

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