體外模擬腦缺血再灌注OGD／R模型的差異凝膠電泳分析

劉守躍，張 影，胡林森，宋 彬，羅毅男，關文明

（1.吉林大學第二醫院神經外科，吉林 長春 130041；2.吉林大學第一醫院兒科，吉林 長春 130021；3.吉林大學第一醫院神經內科，吉林 長春 130021；4.吉林大學第一醫院神經外科，吉林 長春 130021）

體外模擬腦缺血再灌注OGD／R模型的差異凝膠電泳分析

劉守躍1，張 影2，胡林森3，宋 彬1，羅毅男4，關文明1

（1.吉林大學第二醫院神經外科，吉林 長春 130041；2.吉林大學第一醫院兒科，吉林 長春 130021；3.吉林大學第一醫院神經內科，吉林 長春 130021；4.吉林大學第一醫院神經外科，吉林 長春 130021）

目的：通過體外模擬缺血－再灌注損傷（I／R）誘導細胞凋亡的氧糖剝離再灌注（OGD／R）模型的建立，應用蛋白質組學技術觀察凋亡細胞蛋白質組的差異表達，進一步揭示神經元凋亡的發生機制。方法：選用人神經母細胞瘤系SH－SY5Y細胞分為對照組和實驗組，實驗組給予OGD10h／R24h處理建立OGD／R誘導SH－SY5Y細胞凋亡模型，提取對照組和實驗組細胞總蛋白，利用熒光染色雙向差異凝膠電泳技術（2D－DIGE）檢測細胞蛋白質組的差異表達變化。結果：DeCyder軟件分析2D－DIGE凝膠圖像顯示平均分離了（1 800±156）個蛋白質點；與對照組比較，實驗組共有30個蛋白點的表達水平有顯著變化（蛋白表達量上調或下調30%以上），其中22個升高，8個降低，與同時間對照組比較差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結論：應用雙向差異凝膠電泳的蛋白質組學技術在OGD／R模型中發現有差異蛋白的表達。

氧糖剝離／再灌注；蛋白質組學；二維熒光差異凝膠電泳

缺血－再灌注（I／R）引起的神經元遲發性死亡被證明主要是由各種因素誘導的細胞凋亡［1］。缺血－再灌注時多種直接或間接因素引起凋亡相關基因激活和凋亡相關蛋白表達，通過信號通路調控凋亡程序的開關，最終決定神經元的存亡［2－5］。為了深入研究缺血－再灌注誘導的神經元凋亡，很多模擬缺血－再灌注的動物和細胞模型被成功建立起來。利用這些模型的研究涉及凋亡相關的各種損傷因素，包括信號轉導、基因表達及蛋白合成調節、修飾和亞細胞結構等，研究結果顯示：凋亡的調控是一個整合多因素多環節的復雜網絡系統，很多具體機制仍不清楚，特別是關于蛋白質表達變化、加工處理、修飾和相互作用等蛋白質組方面的信息還有很多空白。本實驗在前期氧糖剝離再灌注（OGD／R）誘導SH－SY5Y細胞凋亡模型［6］的基礎上，應用蛋白質組學的手段，即熒光染色雙向差異凝膠電泳（2－dimentional difference gel electrophoresis，2DDIGE）、圖像分析對該模型的差異表達蛋白質進行了研究，為進一步探尋腦缺血性疾病的相關靶蛋白提供基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株、試劑及主要儀器

SH－SY5Y細胞購自中國醫學科學院腫瘤研究所。高糖DMEM購自Gibco公司；優質胎牛血清購自杭州四季青公司；尿素、硫脲、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、3－［（3－膽酰胺丙基）－乙二胺］－1－丙磺酸（CHAPS）、二硫蘇糖醇（DTT）、兩性電解質（pH3～10）、固相 pH 梯 度 （immobilized pH gradient，IPG）干膠條（pH3～10，13cm）、覆蓋油、IPG緩沖液、甘油、十二烷基磺酸鈉（SDS）、碘乙酰胺（IAA）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、甘氨酸、瓊脂糖、蛋白酶抑制劑、核酸酶、胰蛋白酶、三氟乙酸（TFA）、乙腈（ACN）、α－氰基－4－羥基肉桂酸（4－HCCA）及相對分子質量marker、PhastGel Blue、CyDye熒光標記物（Cy2，Cy3，Cy5）、二甲基甲酰胺（DMF）、賴氨酸、IPG干膠條（pH3－10，24cm）、Clean－up試劑盒及2DQuant定量試劑盒等均購自Amersham Biosciences－GE Healthcare公司。hACTH（19－39）和AngⅢ購自Sigma公司。異丁醇、溴酚藍、甲醇、冰醋酸和三氯乙酸（TCA）等購自北京北化精細化學品有限責任公司。CO2培養箱（Heraeus和SANYO）；Ultrospec 3300Pro分光光度計、Ettan IPGphorⅡ等電聚焦儀、Ettan DALT Six電泳系統、Typhoon 9400系列多功能激光掃描系統、DeCyder差異分析軟件為Amersham Biosciences－GE Healthcare公司產品、凝膠圖像掃描儀、ImageMaster 2DEvolution軟件、Ettan切膠儀、Ettan酶切儀、Ettan點靶儀和基質輔助激光解吸／電離飛行時間質譜（MALDITOF MS） 均 為 Amersham Biosciences－GE Healthcare公司產品。

1.2 細胞培養及模型建立

參照文獻［6］進行 SH－SY5Y 細胞培養及OGD／R模型建立，細胞接種的濃度為2×105mL－1。

1.3 采用2D－DIGE檢測差異蛋白

1.3.1 樣品的制備 隨機選取4批不同代數的細胞，設為對照組C1～4和實驗組T1～4。將細胞接種于底面積35cm2培養瓶中，培養24h后，實驗組給予OGD，對照組給予高糖無血清培養基置于37℃、5%CO2孵箱，10h后均更換為含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養基，置于37℃、5%CO2孵箱中繼續培養。24h后傾去培養基，加5mL冷PBS，細胞刮棒刮取對照組和實驗組細胞，移至2個玻璃離心管中，500g、4℃離心6min，棄上清，冷PBS洗滌2～3次，每次5min，將沉淀轉移至1.5mL Eppendorf管中，500g、4℃離心5min。向沉淀中加入細胞裂解儲液（按細胞濕重體積比1∶5～8計算）、1%體積蛋白酶抑制劑、1%體積核酸酶，充分混勻后4℃超聲（調至50%）20次，室溫靜置1h以上，25 000g、4℃離心30min，上清轉移至新的Eppendorf管。應用Clean－up試劑盒去除樣品雜質，取5μL樣品用2D Quant定量試劑盒于分光光度計下進行蛋白質定量（濃度在3～5g·L－1為宜），剩余樣品－70℃凍存備用。

1.3.2 熒光標記 用50mmol·L－1NaOH 溶液將各樣品的pH 值調至8.5～9.0，從 T1～4、C1～4各取50μg，分別以1μL（400pmol）CyDye熒光染料Cy3、Cy5進行相應標記；再取各組樣品25μg混合制成內標，用4μL（1 600pmol）Cy2標記，冰上避光孵育30min。如表1進行分組。加入1μL 10mmol·L－1賴氨酸溶液冰浴避光10min終止反應。

表1 樣品分組與熒光標記Tab.1 Samples grouping and FL labeling

1.3.3 雙向電泳 1向等電聚焦：如表1所示，分別將Gel1～4標記好的3種熒光樣品混合在一起，加入水化液至各膠上樣液總體積為450μL。將上樣液均勻加入對應的IPG膠槽中，膠面朝下放入24cm IPG干膠條，使之完全浸潤，吸取1.4mL覆蓋油覆蓋膠條，置于Ettan IPGphorⅡ等電聚焦電泳儀上，進行水化與等電聚焦。等電聚焦結束之后，IPG膠條可－70℃凍存備用或繼續進行垂直電泳。2向垂直電泳清洗、安裝24cm垂直電泳灌膠模具，每塊膠60mL灌膠液，另加80mL填充液，聚合1h以上 （可室溫過夜），查看凝膠上沿出現水化層時為聚合凝固良好。此時將IPG膠條在平衡液Ⅰ、Ⅱ中各平衡15min。然后將膠條轉移至12.5%的 SDS－PAGE 凝膠 （24cm×20cm×1.0cm）上端與之緊貼，用加熱融化的0.5%瓊脂糖封膠。安裝好循環水管接口及電泳槽，在Ettan DALT Six電泳系統中以40mA恒流電泳轉移60min，然后換用8W （2W／膠）恒功率電泳6h，直至溴酚藍前緣到達PAGE膠的底端。

1.3.4 凝膠圖像掃描 使用Typhoon 9400掃描儀在熒光模式下先以1 000μm的精度粗掃描，在激發波長520、580、670nm及對應的光電倍增管（PMT）電壓值800、500、480V左右的條件下分別收集Cy2、Cy3和Cy5標記的熒光圖像，按粗掃結果調節軟件中的PMT電壓值，使ImageQuant中的各圖像MaxValue值介于60 000～90 000，最后以100μm精度進行精掃描，再次查看MaxValue值，若在上述范圍內將圖像剪切存盤，若超出，則調整PMT重新掃描至結果符合為止。共得到12幅雙向電泳圖像。

1.4 統計學分析

采用DeCyder 5.0版本軟件分析，應用BAV模式進行膠間匹配，定義本次實驗的差異表達蛋白標準：蛋白表達量上調或下調30%以上，同時P＜0.05或P＜0.01。差異蛋白質點組間比較采用顯著性Student－t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

對照組和OGD／R組蛋白質表達差異分析：對8組熒光標記蛋白樣品進行2D－DIGE分離，用DeCyder軟件分析后顯示，4塊凝膠平均分離了（1 800±156）個蛋白點，蛋白點匹配率約為80%。BVA軟件處理后共得到對照組和實驗組30個差異表達蛋白 （蛋白表達量上調或下調30%以上），其中有22個點表達水平上調，8個表達水平下降，與同時間對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。差異表達蛋白點膠圖中的編號、膠中出現的頻數、t檢驗P值、實驗組與對照組表達水平的比率見表2。圖1和2分別是對照組 （Cy3標記）細胞和OGD10h／R組 （Cy5標記）細胞的蛋白電泳膠圖。圖3（封二）是對照組（Cy3標記）、OGD10h／R組 （Cy5標記）、內標組（Cy2標記）及3組蛋白重疊的二維熒光膠圖。圖4從整體到局部放大詳細標記出了DeCyder軟件檢測到的差異表達蛋白質點膠圖中的位置、編號、表達豐度的變化。

3 討 論

前期實驗［6］通過檢測對照組和 OGD／R組SH－SY5Y細胞活力、形態學變化、細胞氧化應激相關酶及代謝物、流式細胞術多項指標證實了OGD10h／R模型成功誘導了SH－SY5Y細胞的凋亡，并認為再灌注24h細胞凋亡明顯，比例高，適合進一步進行凋亡發生機制的相關研究。本研究在前期實驗的基礎上應用2D－DIGE蛋白質組學方法對凋亡相關蛋白質組的變化進行了初步探索。二維熒光差異凝膠電泳技術是由Unlu等［7］發明。實驗時不同樣品蛋白分別用熒光染料Cy3、Cy5和內標Cy2標記，內標是所有樣品的等比例混合體［8］，以不同的激發波長掃描膠圖，得到樣品中蛋白點的相對豐度值。DIGE和傳統的二維凝膠電泳（2－DE）相比具有很多的優點：①內標Cy2使樣品信號的比較具備統一的基準，進而最大限度縮小了膠間差異；②熒光素相對分子質量和電荷相匹配，且與蛋白的比率低，使不同樣品同時電泳時蛋白點定量和配對更容易；③蛋白點能夠檢測到pg量級，靈敏度更高，線性更寬，統計學更可靠；④可顯著提高樣品電泳通量，減少操作時間和工作量；⑤DIGE與質譜兼容［8－9］。因此，DIGE是目前差異蛋白質組研究中可信度和精確度最高的方法之一［10－12］。

表2 對照組及OGD10h／R組差異表達蛋白統計分析Tab.2 Statistical analysis of differential proteins between control and OGD10h／R groups

圖1 Cy3標記的對照組SH－SY5Y細胞的蛋白電泳膠圖Fig.1 2－DE of Cy3－labeled proteome extracted from SHSY5Ycells in control groups

圖2 Cy5標記的OGD10h／R組SH－SY5Y細胞的蛋白電泳膠圖Fig.2 2－DE of Cy5－labeled proteome extracted from SHSY5Ycells in OGD10h／R groups

本實驗研究了OGD10h／R誘導SH－SY5Y細胞凋亡模型的差異表達蛋白，結果顯示：共發現30個有統計學意義的差異表達蛋白，其中22個點表達水平升高，8個點表達水平降低，其是否在缺血再灌注損傷中發揮重要作用還有待于進一步研究證實。OGD／R組與對照組差異表達蛋白質的分析結果說明了細胞內很多蛋白成分在缺血再灌注的病理生理過程中發生了改變，而這些變化的蛋白可能參與了神經細胞對缺血再灌注損傷的耐受與抵抗。通過對這些差異表達蛋白的進一步分析鑒定，可以發現與病理生理改變密切相關的特異性蛋白，本研究結果為探索缺血再灌注損傷引起神經元凋亡的機制提供新的線索，同時也可能作為神經細胞缺血再灌注損傷的分子標記，為治療及藥物開發提供新的靶點。

到目前為止，本實驗尚不能確定上述差異表達蛋白的種類，因此無法深入分析這些差異表達蛋白在神經元缺血再灌注損傷過程中的功能，以及相互作用關系，只有對這些發生變化的蛋白進行鑒定后才可能對其機制做出進一步合理解釋。因此后續工作主要集中于應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜 （MALDI－TOF MS）鑒定差異表達蛋白，并通過生物信息學方法分析上述蛋白在缺血再灌注后 神經細胞凋亡過程的作用及其相互關聯性。

圖4 Decyder軟件檢測的差異表達蛋白質點整體及局部放大膠圖Fig.4 Overview and zoom of differential proteins detected by Decyder software

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Difference gel electrophoretic analysis of OGD／R modelinvitroto mimic ischemia and reperfusion

LIU Shou－yue1，ZHANG Ying2，HU Lin－sen3，SONG Bin1，LUO Yi－nan4，GUANG Wen－ming1
（1.Department of Neurosurgery，Second Hospital，Jilin University，Changchun 130041，China；2.Department of Pediatrics，First Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China；3.Department of Neurology，First Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China；4.Department of Neurosurgery，First Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective To build oxygen glucose deprivation／reperfusion（OGD／R）modelinvitroto mimic ischemia and reperfusion inducing apoptosis of SH－SY5Ycells，to detect differential proteins by employing proteomics technique and to reveal the potential mechanisms of neuronal apoptosis.Methods SH－SY5Ycells were employed and divided into control group and experimental group in which the cells treated with OGD10h／R24hto set up apoptosis model.After the proteins were extracted from SH－SY5Ycells in control and OGD10h／R24hgroups，2DDIGE techniques was used to detect differential proteins.Results By DeCyder software mean（1 800±156）protein spots were displayed on 2D－DIGE image.In OGD10h／R24hgroup，30protein spots were detected to differentially express compared with control group，of which 22spots were up－regulated and 8spots were downregulated.Compared with control groups at the same time，the differences were significant（P＜0.05orP＜0.01）.Conclusion By employing 2D－DIGE proteomics techniques to analyse OGD／R model，the protein spots are detected to differentially express.

oxygen glucose deprivation／reperfusion；proteomics；2－dimentional difference gel electrophoresis

Q51；R743.31

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0861－05

2012－05－03

吉林省科技廳科研基金資助課題 （200905151）

劉守躍 （1971－），男，吉林省長春市人，主治醫師，醫學博士，主要從事腦血管病基礎與臨床研究。

關文明 （Tel：0431－88796286，E－mail：lsy2007.2008＠yahoo.com.cn）