新疆南疆地區奶牛乳房鏈球菌gapC基因原核表達載體的構建

張 輝 焦海宏 陳 偉，*

乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)作為引起奶牛乳房炎(mastitis)的主要致病菌之一，致病性與多種毒力因子相關。其中乳房鏈球菌gapC基因編碼的具有3－磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)活性的一種表位蛋白，即GapC蛋白，是近年來研究較多的一種毒力蛋白，也被認為是一種與毒力相關的免疫調節蛋白［1］。GapC蛋白能與血纖維蛋白溶酶結合，在疾病發展過程和信號轉導過程中起著重要作用，可作為疫苗發展的良好靶位點［2，3］。因此，研究GapC蛋白的功能可為乳房鏈球菌抗原的篩選、疫苗的研制和奶牛乳房炎的防治提供一定的理論指導。

本研究通過PCR方法擴增乳房鏈球菌臨床分離株的gapC基因，應用基因重組技術，構建乳房鏈球菌gapC基因原核表達載體 pET－32a(+)－gapC，并進行GapC蛋白的誘導表達，獲得GapC蛋白最佳誘導表達條件，為后續應用該蛋白進行免疫學研究，確定其免疫原性及免疫保護作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器

PCR儀(Bio－Rad)，恒溫培養箱(Boxun，上海)，移液器(Eppendorf)等。恒溫水浴鍋(金壇市醫療器械廠)，金屬浴(金銀杏生物科技，北京)，凝膠成像系統(Bio－Rad)，蛋白電泳儀(北京六一儀器廠)，高速臺式離心機(Eppendorf)。

1.2 實驗藥品與試劑

限制性內切酶E coRⅠ、X hoⅠ、T4 DNA連接酶、IPTG、氨芐青霉素(AMP)、DNA分子量標準(DL2 000，DL10 000)與表達載體pET－32a(+)均購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR試劑購自東盛生物有限公司;質粒小提試劑盒、普通DNA產物純化試劑盒購自北京天根生物有限公司;蛋白質分子量標準、TEMED、考馬斯亮藍、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、DTT均購自Ameresco公司;其它試劑均為國產分析純或試劑純;BHI培養基(Becton Dickinson)。

1.3 實驗菌株

乳房鏈球菌菌株分離自新疆南疆地區某奶牛場患乳房炎病牛的乳樣，E.coli DH5a、BL21(DE3)為本實驗室保存。

1.4 目的基因gapC的PCR擴增

1.4.1 引物的設計與合成

根據Genbank公布的基因序列，查找乳房炎性鏈球菌的gapC基因，設計引物。上游引物為Pet32a－F:5’－ GAGGAATTCATG GTA GTT AAA GTT GGT ATT AAC G －3’，下游引物為Pet32a－R:5’－GGACTCGAGTTA TTT AGC GAT TTT TGC AAA GTA C－3’，預期片段約為1011 bp。上游引物中引入E coR I酶切位點，下游引物中引入X ho I酶切位點(見下劃線部分)，由上海生工生物工程技術服務有限公司進行合成。

1.4.2 乳房鏈球菌基因組DNA的提取

挑取活化好的乳房鏈球菌單菌落接種于BHI液體培養基，37℃培養18 h左右，12 000 rpm離心5 min收集菌體，按文獻［4］操作步驟稍作改動，提取乳房鏈球菌基因組DNA，于－20℃冰箱保存備用。

1.4.3 gapC 基因的 PCR 擴增

以乳房鏈球菌基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系如表1所示。反應條件:95℃變性5 min;94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30 個循環;72℃延伸10 min。取適量PCR產物電泳檢測(1%瓊脂糖凝膠、120 v、30 min)，EB 染色10 min，凝膠成像系統成像。將所有PCR產物合并后用DNA產物純化試劑盒(TIANGEN BIOTECH)純化回收，于－20℃冰箱保存備用。

表1 目的基因gapC擴增體系

1.5 重組表達質粒的構建

1.5.1 質粒載體的純化

將含有質粒載體pET－32a(+)的大腸桿菌DH5a活化、搖菌后，用質粒小提試劑盒(TIANGEN BIOTECH)進行質粒載體的抽提(方法與步驟見質粒小提試劑盒說明書)。電泳檢測抽提效果后，于－20℃冰箱保存備用。

1.5.2 載體及目的基因雙酶切

將載體pET－32a(+)用限制性內切酶(E coR I、X ho I)進行雙酶切，電泳檢測后，用DNA產物純化試劑盒(TIANGEN BIOTECH)回收載體大片段。同時用與酶切載體相同的內切酶進行目的基因gapC的雙酶切與純化。

1.5.3 表達載體的構建

取約20 ng(1μL)酶切回收后的載體pET－32a(+)DNA片段，加適量目的基因gapC片段、1μL10×T4 DNA連接緩沖液、1μL T4 DNA連接酶，加ddH2O至10μL，混勻后置于16℃連接過夜。連接產物轉化至E.coli DH5a感受態細胞中，經PCR和限制性內切酶篩選鑒定，送陽性克隆進行測序。測序正確的陽性克隆進行重組質粒的抽提(方法同前)，轉化E.coli BL21(DE3)。將鑒定正確的陽性質粒命名為pET－32a(+)－gapC。

1.6 重組蛋白的誘導表達

1.6.1 樣品的制備

取測序正確的菌株(編號B－21)，同時以含質粒pET－32a(+)的菌體為對照，接種于含 Amp的液體LB培養基中，37℃ 振蕩培養過夜。取此培養物按1%(v/v)的量接種于準備好的含Amp的液體LB培養基中(100 mL)，37℃ 振蕩培養至OD600值0.4～0.6(約2～3 h)，加 IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續在37℃振蕩培養，并在培養的不同時刻(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 h)各取 1 mL 菌液轉移至離心管，10 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，加入90μL 1×上樣緩沖液和10μL 1 mol/L DTT懸浮混勻，沸水浴5 min，10 000 r/min離心5 min。同時將蛋白質分子量標準在沸水中處理5 min。1.6.2 重組蛋白的 SDS－PAGE檢測

制備合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠(12%分離膠，5%濃縮膠)，每孔加入20μL樣品，在濃縮膠中采用8 V/cm的電壓進行電泳，在分離膠中采用15 V/cm的電壓進行電泳。電泳結束后取出凝膠用考馬斯亮藍R－250染色液染色30 min左右，然后脫色至背景清晰，用清水沖洗、掃描照相。

1.7 重組蛋白最佳誘導條件的確定

1.7.1 最佳誘導時間的確定

樣品處理方法同前，選擇在培養液中加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L和1 mmol/L，并分別在誘導的不同時間點(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 h)各取 1 mL菌液轉移至離心管，進行SDS－PAGE檢測。

1.7.2 最佳IPTG誘導濃度的確定

確定最佳誘導時間后，進行IPTG最佳誘導濃度的確定。在培養液中加入終濃度依次為 0.0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L、1.25 mmol/L 的IPTG，同時設立空質粒對照，培養至最佳誘導時間時取樣，方法同前，進行SDS－PAGE檢測。

2 結果和分析

2.1 目的基因gapC的擴增與序列分析

以乳房鏈球菌基因組DNA為模板，PCR擴增特異性片段并回收，PCR產物及回收產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示，PCR擴增產物在略大于1 000 bp處有一條清晰明亮的DNA條帶(圖1)，與預期片段大小相符。克隆測序后表明為乳房鏈球菌的gapC基因。

圖1 gapC基因的PCR擴增(M為DNA Marker DL2000，1為gapC基因)

2.2 重組表達質粒的構建與鑒定

2.2.1 重組表達質粒的PCR鑒定

將所構建的原核表達質粒 pET－32a(+)－gapC，轉化 E.coli BL21(DE3)，氨芐抗性篩選，對抗性平板上長出的克隆用基于載體設計的通用引物(T7，S－Tag)進行PCR鑒定，疑似陽性克隆12個。部分重組子PCR鑒定結果如圖2所示。

圖2 重組質粒的PCR鑒定(+:以質粒pET－32a(+)－gapC為模板作陽性對照，－:以質粒pET－32a(+)為模板作陰性對照，空:以ddH2 O為模板作空白對照;1、2為待檢重組子;M為DNA Marker DL2000)

2.2.2 重組表達質粒的酶切鑒定

對PCR鑒定后陽性重組子抽提質粒后電泳檢測。結果顯示，重組質粒pET－32a(+)－gapC比質粒pET－32a(+)略大(見圖3)。酶切結果顯示，重組質粒經E coR I單酶切后產生一條約7 kb的DNA條帶，與預期大小6 883 bp相符。經E coR I、X ho I雙酶切后出現的兩條 DNA條帶與實際大小(約5.9 kb和1 kb)相符，說明重組質粒構建正確。

圖3 重組質粒酶切鑒定(1為空質粒pET－32a(+)，2為pET－32a(+)雙酶切;3、6為重組質粒pET－32a(+)－gapC;4、5為pET－32a(+)－gapC雙酶切;7為pET－32a(+)－gapC單酶切;M為DNA分子量標準)

2.3 重組GapC蛋白最佳誘導條件的確定

2.3.1 重組蛋白最佳誘導時間

IPTG在不同誘導時間對重組質粒pET－32a(+)－gapC表達量有明顯影響。未加入IPTG時，重組蛋白產生量極少。當誘導1 h時，表達量開始上升，一直持續到5 h。6 h時表達量達到最高，隨后表達量略有下降。誘導9 h時，仍有足量的重組蛋白表達(圖4)。因此，確定最佳誘導時間為6 h。

圖4 不同誘導時間重組蛋白的檢測(A:0.5 mmol/L IPTG誘導，B:1.0 mmol/L IPTG誘導)(1、9、13為質粒pET32a(+)分別誘導0 h、6 h和9 h;2～8、10～12為重組質粒pET－32a(+)－gapC分別誘導0～9 h;M為蛋白分子量標準)

2.3.2 重組蛋白IPTG最佳誘導濃度

在確定最佳誘導時間的基礎上，進一步確定IPTG最佳誘導濃度。結果表明，IPTG在0～1.25 mmol/L濃度范圍內，在最佳誘導時間即誘導6 h時，GapC蛋白的表達量隨著IPTG濃度的增大而逐漸增加(如圖5所示)，當IPTG濃度為0.5 mmol/L時，表達量已達到最高。IPTG濃度為0.75 mmol/L和1.0 mmol/L時，GapC蛋白的表達量較 0.5 mmol/L時無明顯變化，而當IPTG濃度提高到1.25 mmol/L時表達量有所降低，說明高濃度的IPTG會抑制重組蛋白的表達。因此，確定最佳誘導濃度為0.5 mmol/L。

圖5 不同濃度IPTG誘導6 h重組蛋白的檢測(1、8為質粒pET32a(+)分別誘導0 h和6 h;2～7為重組質粒pET－32a(+)－gapC分別在0～1.25 mmol/L 6種不同濃度IPTG誘導下的表達情況，M為蛋白分子量標準)

3 討論

奶牛乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，給奶業發展造成了嚴重的經濟損失。治療該病目前主要以抗生素為主。但由于抗生素的殘留和耐藥菌的出現，使得治療難度增加，而利用疫苗來控制該病已成為一種趨勢。病原微生物的某些生理代謝酶，是一些功能蛋白作用的良好受體，可作為疫苗的重要靶分子。研究表明具有3－磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)活性的蛋白是細菌、真菌和寄生蟲感染的最佳疫苗靶向［5－7］。而鏈球菌 gapC基因編碼的具有GAPDH活性的表面保守性蛋白，即GapC蛋白，是近年來最受關注的一種毒力蛋白。

不同種類細菌其gapC基因同源性存在很大差異，已經有研究報道引起奶牛乳房炎的三種鏈球菌(無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌)之間gapC基因同源性高達88%［8］。這種基因高同源性的存在為利用該基因表達產物獲得免疫保護提供了理論基礎。

有研究表明gapC基因編碼產物3－磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH)可與纖維蛋白溶酶結合，以助于病原菌在宿主體內定殖［9，10］。因此，從削弱鏈球菌定殖機體能力的角度出發，針對GADPH蛋白研制鏈球菌性奶牛乳房炎疫苗具有潛在的應用前景。

gapC基因ORF全長1 011 bp，編碼一條336個氨基酸的功能多肽。當gapC與表達載體pET32a(+)連接，構建原核表達系統時，目的蛋白以融合蛋白的形式表達。融合蛋白包括Trx－Tag(分子量約11.7kD)、His－Tag(分子量約0.8 kD)、S－Tag(分子量約1.7 kD)、與目的蛋白相連接的部分氨基酸(分子量約3.8 kD)和目的蛋白GapC(分子量約36.0 kD)。所產生的融合蛋白分子量約54.0 kD(介于43 kD～66.2 kD之間)。同時應用生物學軟件DNAStar對推導的融合蛋白氨基酸序列進行分析，推測其分子量約為53.8 kD，二者結果一致。本研究中SDS－PAGE檢測結果表明，重組蛋白分子量介于43 kD～66.2 kD之間，與預期大小相符，表明重組蛋白成功獲得表達。

本研究成功構建了乳房鏈球菌gapC基因原核表達載體并獲得最佳誘導條件。誘導實驗表明，當IPTG濃度為0.5 mmol/L，誘導時間為6 h時，重組蛋白的表達量達到最高。持續誘導至9 h時，仍可獲得大量重組蛋白。但隨著誘導時間的增加，表達量不再升高，卻有逐漸下降的趨勢，很可能是重組蛋白合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊而形成了包涵體。本實驗確定的GapC蛋白最佳表達條件與褚明亮等［11］的結果有所不同，可能是在實驗設計及方法選擇上有所不同。在本實驗中，0.5 mmol/L和1.0 mmol/L的IPTG對目的蛋白表達量的影響并無明顯區別。考慮到過高濃度的IPTG可能會使目的蛋白更容易產生包涵體，對后續目的蛋白的純化實驗造成不良影響，因此，在既滿足實驗要求，又不浪費實驗藥品的前提下，我們選擇IPTG濃度為0.5 mmol/L作為目的蛋白的最佳誘導濃度。GapC蛋白的成功表達和最佳表達條件的建立，為下一步制備重組蛋白抗體、確定抗體免疫原性及免疫保護作用奠定了基礎。

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