新疆硝爾庫勒鹽湖放線菌分離方法的初步研究

陳正軍 關統偉 張利莉*

放線菌是一類具有高G+C%含量的革蘭氏陽性細菌，由于菌落呈放射狀而得名，因其產生許多重要的生物活性物質而受到微生物學家的廣泛關注［1］。目前在醫藥和農業上應用的抗生素中大約2/3是由放線菌生產的［2］。當人們從普通環境中尋找新型活性物質日益困難時，極端環境成為人們發現新放線菌物種及新生物活性物質的沃土。目前普遍認為，用一般的分離方法從環境樣品中獲得的微生物純培養物重復性非常高，也很難再分離到新物種，研究也發現多數用于普通環境放線菌分離的培養基并不適用于高鹽環境放線菌的分離［3，4］，這無疑限制了極端環境微生物資源的挖掘。因此，探索有效的微生物分離方法，從不同角度、不同層次建立分離微生物的新方法就成了微生物工作者一項長期的任務［5］。本研究站在營養生理學的角度，考慮到鹽湖是一個高鹽、寡營養的特殊環境和高鹽環境放線菌生長緩慢等因素，以微生物對滲透壓的調節機制為指導，設計了以不同碳源和氮源為基礎的多種不同類型的培養基，以期為高鹽環境放線菌的分離提供有價值的信息。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

鹽湖沉積物樣品于2009年11月采自位于新疆阿圖什市境內的硝爾庫勒湖。該湖呈東北－西南向分布，湖長18～20 km，寬2～4 km，面積 45 km2，海拔為 1 585 m(76°53＇E，40°10＇N)［6］。樣品采集后立即裝入無菌的封口袋并置于車載冰箱。運抵實驗室后于－20℃保存備用。稱取適量沉積物置于無菌培養皿中，放于室溫自然風干25～30 d。

1.2 主要實驗儀器及試劑

PCR儀為德國SensoQuest Labcycler;高速冷凍離心機為BeckMan公司Allegra 64R Centrifuge;凝膠成像分析系統為Bio－Rad公司Gel Doc 2000;電泳儀為北京六一DYY－6C;用于PCR擴增的全套試劑均購自廣州東盛生物科技有限公司;限制性內切酶Hae III及連接試劑盒PMD18－T購自TaKaRa公司;其他生化試劑均為國產分析純。

1.3 分離培養基

實驗中使用的分離培養基為海藻糖－脯氨酸培養基(TP)［7］、甘露醇 － 酸水解酪蛋白培養基(GW1)［8］、殼聚糖 － 天冬酰胺培養基(F6)［9］和筆者設計的8種培養基。8種培養基使用不同的碳源和氮源(A1:海藻糖5 g、酸水解酪蛋白2 g;A2:棉籽糖4 g、酸水解酪蛋白2 g;A3:木聚糖5 g、酸水解酪蛋白2 g;A4:殼聚糖5 g、酸水解酪蛋白2 g;B1:海藻糖5 g、天冬氨酸1 g;B2:海藻糖5 g、谷氨酸1 g;B3:海藻糖5 g、肌酸 1 g;B4:海藻糖 5 g、谷氨酰胺1 g)同時添加相同的基礎培養基(K2HPO41 g、Mg-SO4·7H2O 1 g、CaCO30.2 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、ddH2O 1 L 、Agar 18 g、pH 7.2－7.4、微量鹽 1 mL(0.001 g/L)、復合維生素 1 mL(0.5 mg/L))。以上所有培養基均添加1.5%、5%、10%、15%、20%、25%6個濃度梯度的NaCl，并加入50 mg/L的重鉻酸鉀做為非目的菌抑制劑。

1.4 放線菌菌株系統發育分析

菌株基因組DNA的提取采用酶解法小量提取總DNA方法［10］，16S rRNA的PCR擴增采用引物PA(5＇－ CAGAGTTTGATCCTGGCT － 3＇)和 PB(5＇－AGGAGGTGATCCAGCCGCA －3＇)［11］。反應體系(50 uL)為:Taq酶0.2(5 U);10×buffer 5;dNTPs 1(10 mM);PA:1(10 uM/L);PB:1(10 uM/L);BSA:5(25 mg/mL);ddH2O:35.8;模板1。擴增條件為:94℃預變性4 min;94℃變性1 min;56℃退火1 min;72℃延伸2 min;35個循環;72℃總延伸8 min。將擴增產物純化后送到上海生物工程有限公司進行測序。將測序結果通過Blast程序提交到GenBank數據庫中進行相似性比對搜索，下載相關屬、種近緣菌株的16S rRNA基因序列，構建系統進化樹。用MEGA4.1軟件中的Clustal程序進行多序列比對，將生成的文件用鄰接法(neighbor－joining)構建系統進化樹。采用bootstrap法［12］，重復1 000次取樣，分析進化樹拓撲結構穩定性。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對放線菌分離的影響

本實驗設計了以傳統的酸水解酪蛋白為氮源，以海藻糖、棉籽糖、木聚糖、殼聚糖為碳源的不同培養基，以文獻中報道的分離嗜鹽放線菌效果較好的GW1和F6培養基作為對照，結果見表1。

表1 不同碳源對放線菌分離的影響

從表1可以看出，共獲得4個屬10個不同種的放線菌。實驗組4種培養基中A1培養基(海藻糖－酸水解酪蛋白)可以分離到3個屬3個不同種的放線菌，分離效果最好。同時表明本課題組的經典培養基GW1、F6培養基用于分離硝爾庫勒湖放線菌也可以獲得較好結果。因此認為海藻糖、甘露醇是分離鹽環境放線菌的最佳碳源。這可能是因為海藻糖和甘露醇都是比較重要的滲透調節物質;而殼聚糖是一種氨基葡萄糖，棉籽糖是植物界廣泛存在的一種三糖，木聚糖則是植物細胞壁中主要的半纖維素成分。因此，分離高鹽環境放線菌時，以一些可以充當滲透調節物的二糖作為碳源是比較理想的選擇。

值得注意的是，A4培養基(殼聚糖－酸水解酪蛋白)僅分離到1個屬1個種的放線菌，F6培養基(殼聚糖－天冬酰胺)卻能分離到3個屬5個不同種的放線菌。盡管A4培養基和F6培養基使用的碳源相同，但是當培養基中的氮源不同時分離結果卻截然不同，這啟發我們氮源在分離鹽環境放線菌中具有重要的作用，同時具有滲調作用的氮源可能在分離鹽環境放線菌中顯得更為重要。

2.2 不同氮源對放線菌分離的影響

以分離效果最好的海藻糖作為碳源，分別以天冬氨酸、谷氨酸、肌酸和谷氨酰胺做為氮源設計了4種不同的分離培養基，并且以文獻中報道的TP培養基作為對照，結果見表2。

表2 不同氮源對放線菌分離的影響

從表2可以看出，共分離到11個屬22個不同種的放線菌。以肌酸作為氮源的培養基(B3)分離效果最好，能分離到10個屬16個不同種的放線菌。從分離放線菌種屬的數量來看，以天冬氨酸和谷氨酸作為氮源的培養基(B1、B2)比以谷氨酰胺和脯氨酸作為氮源的培養基(B4、TP)分離效果好，均能分離到5個屬7個不同種的放線菌。比較表1和表2的分離結果發現，B3(海藻糖－肌酸)培養基分離到放線菌種屬的數量要遠遠超過其它所有的培養基。因此，B3培養基可以作為分離鹽湖放線菌的最佳培養基。

2.3 放線菌菌株系統發育分析

以16SrRNA相似性小于97%來做為新種和已知種的界限［13］，培養基B1(海藻糖－天冬氨酸)和B2(海藻糖－谷氨酸)各分離到一個潛在的新種(菌株編號分別為41376、41293)，將這兩株菌的16S rRNA序列同 GenBank數據庫中已知序列進行比對，結果同最近種的相似性分別為93%和96%，以鄰接法對這兩株菌分別構建系統發育樹 (圖1、圖2)，結果表明菌株41376和41293分別以極高的自展值在各自的屬內形成獨立的分枝，這兩株菌可能分別是鹽放線孢菌屬和鏈霉菌屬的潛在新種，其確切的分類地位還要通過多相分類手段進一步鑒定。從發現新種的角度來看，具有滲調作用的不同碳源、氮源組合的培養基，可能在分離鹽環境放線菌中具有更大的潛力。

圖1 基于16SrRNA序列的菌株41376的系統進化樹

圖2 基于16SrRNA序列的菌株41293的系統進化樹

3 討論

由于放線菌是一類具有巨大應用價值的微生物，所以開發放線菌資源就顯得尤為重要。一直以來，分離方法一直是限制人們開發利用這類微生物資源的“瓶頸”，尤其是高鹽環境下放線菌的純培養技術一直沒有突破。所以尋找新的思路、探索新的分離方法就成了放線菌資源研究的主要內容之一。分析以上研究結果發現，實驗中使用的11種培養基中B3培養基的分離效果最好，分離到放線菌屬和種的數量最多。分析其培養基組成發現:B3培養基使用的碳源是海藻糖，氮源是肌酸。海藻糖是一種重要的抗逆物質，自身性質非常穩定，能在細胞表面形成特殊的保護膜，因此能有效的保護生物活性物質不變性失活，被認為是生物抵御環境脅迫的應激代謝物［14］，微生物在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環境條件下都能合成海藻糖。肌酸由精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸合成，因此在培養基中它是很好的氮的供體。B1和B2培養基分離效果雖然次于B3培養基，但是同其它8種培養基相比分離效果還是比較好，均能分離到5個屬7個不同種的放線菌，甚至能分離到一些新的物種。這兩種培養基所使用的氮源分別是天冬氨酸和谷氨酸，有報道認為［15，16］微生物為了緩解高滲透壓，則通過有機小分子酸性氨基酸以及通過天門冬氨酸和谷氨酸途徑合成甜菜堿、四氫嘧啶等衍生物，這些滲透物質可以迅速地從培養基和環境中被吸收和積累，從而使微生物細胞保持穩定的滲透壓。本研究也發現，由于樣品來源不同，相同培養基的分離效果也有較大差異。也有研究［17］發現十分之一的Gibbson培養基分離嗜鹽菌的效果要明顯優于Gibbson培養基。因此，分離高鹽環境的微生物可以考慮用不同的滲透調節物做為碳源和氮源，同時利用高鹽環境微生物寡營養的特點改造或設計培養基。

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