甘草酸二胺對大鼠腦出血后腦水腫的療效研究

付懷棟，林福軍，潘永進(jìn)，王秀彬，杜守云

（1.灌云縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 灌云 222200；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南通 226001）

腦出血后引起機(jī)體和腦組織局部一系列病理生理變化，在血腫周圍的腦組織形成水腫帶，繼而引起神經(jīng)細(xì)胞及其軸突的變性、壞死，導(dǎo)致病情惡化和影響預(yù)后。腦出血后炎癥反應(yīng)在腦水腫和神經(jīng)損傷過程中起重要作用，且程度較非出血性損傷嚴(yán)重，腦出血后血凝快及受損腦組織可釋放多種趨化因子，激活炎性細(xì)胞，并使其向血腫及周圍腦組織轉(zhuǎn)移，進(jìn)而導(dǎo)致腦水腫和腦損傷，因此，抑制炎癥反應(yīng)能減輕腦水腫。2010年1月至2011年9月本研究用甘草酸二胺注射液來治療大鼠腦出血后腦水腫，觀察其對腦水腫的治療作用，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物與分組 選取健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供。分為假手術(shù)組、腦出血模型組（模型組）、甘草酸二胺治療組（治療組），每組12只。

1.2 主要試劑及儀器 甘草酸二胺(50mg/支，江蘇天晴)；大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、ELISA試劑盒（深圳欣博盛生物公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物公司)；酶標(biāo)儀(Elx-800，美國Bio-tek公司)；GE Signa Excite HD 3.0 T MR機(jī)；鼠頭立體定位儀(上海江灣I型C)；電熱恒溫干燥箱(10lAB-3，海門市恒昌儀器廠)。

1.3 動物模型制備 參照Rosenberg等[1]報道的方法制備大鼠腦出血模型，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(350 mg/kg)，將其俯臥位固定在立體定位儀上，調(diào)節(jié)門齒托的高度，使大鼠前囟、后囟處于同一水平，沿頭皮正中切一長約10 mm切口，用30%雙氧水腐蝕顱骨上腱膜及顱骨外膜，無菌操作暴露前囟，定位于前囟前0.2 mm，中線向右旁開3 mm處鉆一直徑為1 mm的小孔，進(jìn)針深度為5.5 mm(即尾殼核位置)。用40℃水溫浴大鼠尾巴約5 min后取出擦干，酒精消毒后，在距離大鼠尾巴末端2～3 mm處剪斷鼠尾，斷尾取血50μl，用微量進(jìn)樣器在3～4 min內(nèi)緩慢注入，注血結(jié)束后留針10 min后緩慢退針，局部用骨蠟封閉后縫合皮膚。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行，術(shù)畢將大鼠放回籠中飼養(yǎng)，自由活動進(jìn)食進(jìn)水。假手術(shù)組不向腦內(nèi)注血。術(shù)后24 h，治療組給予甘草酸二胺50 mg/kg腹腔注射，1次/d，模型組給予等量的生理鹽水注射，假手術(shù)組不做處理。

1.4 頭顱MR掃面 大鼠腦出血模型制備24 h，對所有大鼠進(jìn)行頭顱MR掃描，判斷腦出血模型是否成功，即在右側(cè)基底節(jié)區(qū)形成大小一致的血腫，血液沒有破入腦室及蛛網(wǎng)膜下腔。第5天對各組大鼠進(jìn)行掃描，觀察血腫大小及血腫周圍水腫。掃描序列為，軸位T2WI：FRFSE-XL/90，TR 5000 ms，TE 85 ms，F(xiàn)OV 9.0 cm×5.4 cm，層厚1mm，間隔0.1，NEX 320/224/2。冠狀位 T2WI：FRFSE-XL/90，TR 2 000 ms，TE 85 ms，F(xiàn)OV 8.0 cm×8.0 cm，層厚1 mm，間隔0.1，NEX 320/192/2。

1.5 腦組織含水量測定 各組分別選擇6只動物，在冰塊上迅速取腦，取出大鼠腦組織（去除表面凝血），將取出的腦組織沿中線分為左右兩側(cè)大腦，放在一個內(nèi)有生理鹽水濕潤的培養(yǎng)皿中，以防水分蒸發(fā)，用電子天平測其濕重，然后于90℃烤箱烘烤72 h至恒重，取出稱干重，用干濕法計算含水量：腦含水量＝(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6 炎癥細(xì)胞因子含量測定 每組分別隨機(jī)選取6只大鼠，斷頭取腦，在血腫周圍取腦組織0.5 g，加生理鹽水稀釋10倍，用玻璃勻漿器在冰上研磨，制成腦組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行超濾離心，最后取上清液進(jìn)行TNF-α、IL-1β、IL-6含量測定。從已平衡至室溫的密封袋中取出所需板條，除空白孔外，分別將勻漿上清液或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入相應(yīng)孔中，先后分別加入生物素化抗體工作液、酶結(jié)合工作液，顯色劑之間各洗板4次，最后加入終止液，混勻后即刻測量OD450值，最后根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各濃度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)資料表達(dá)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因方差分析(ANOVA)，組間均數(shù)兩兩比較用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 頭顱磁共振掃描 大鼠腦出血模型制備24 h后，對所有大鼠進(jìn)行頭顱MRI掃描，模型制作成功的大鼠，可見在右側(cè)基底節(jié)區(qū)形成大小一致血腫。血液破入腦室或蛛網(wǎng)膜下腔，形成的血腫大小不一致或沒形成血腫的大鼠，排除出本試驗，重新予以補(bǔ)充。術(shù)后第5天對各組大鼠再次進(jìn)行掃描發(fā)現(xiàn)，血腫為低信號，模型組血腫周圍可見較大范圍的高信號，考慮為腦水腫，而治療組血腫周圍未見明顯高信號。

圖1 大鼠俯臥位掃描

2.2 腦含水量測定 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織含水量明顯升高(P＜0.01)。經(jīng)甘草酸二胺治療后，腦組織含水量較模型組明顯降低(P＜0.01)，見表1。

表1 各組腦組織含水量比較（±s）

表1 各組腦組織含水量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別腦含水量（%）動物數(shù)（只）假手術(shù)組模型組治療組75.59±0.33 78.23±0.39*76.16±0.20#666

2.3 炎癥細(xì)胞因子含量測定 與假手術(shù)組比較，模型組TNF-a、IL-6、IL-1β水平明顯升高，與模型組比較，治療組 TNF-a、IL-6、IL-1β水平降低(P＜0.01)，見表2。

表2 炎性細(xì)胞因子水平的比較（±s，ng/g）

表2 炎性細(xì)胞因子水平的比較（±s，ng/g）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

假手術(shù)組模型組治療組666 1.02±0.44 8.84±1.04*5.24±1.06#2.34±0.54 7.01±1.20*4.24±0.81#0.66±0.23 2.20±0.40*1.61±0.29#

3 討論

實驗研究不僅需要建立與臨床一致的動物模型，還需要有可靠的檢測方法來判斷模型制作是否成功。王秀彬等[2]研究顯示，用3.0 T MR結(jié)合串聯(lián)線圈為活體大鼠模型的MR檢查提供了很好的方法。本研究中，我們應(yīng)用MR掃描來判斷大鼠腦出血模型制作是否成功，MR掃描顯示在右側(cè)基底節(jié)區(qū)形成大小一致血腫的大鼠納入本實驗，血液破入腦室或蛛網(wǎng)膜下腔，排除出本研究，這種方法直觀、可靠，克服了以往利用神經(jīng)行為學(xué)檢測來判斷模型制作是否成功的不確定性、人為干擾因素大等缺點，使制作的模型具有一致性。

在本研究中，我們運用干濕重法測定大鼠腦含水量發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦含水量明顯高于假手術(shù)組，而甘草酸二胺治療組腦含水量明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而且頭顱MR亦顯示模型組大鼠血腫周圍有較大范圍的高信號，考慮為血腫周圍水腫，而治療組血腫未見明顯高信號，這說明甘草酸二胺能減輕大鼠腦出血后腦水腫。

腦出血后炎癥反應(yīng)在腦水腫形成過程中起重要作用，正常腦組織中炎性細(xì)胞因子表達(dá)極微，但是腦出血后，血凝塊及受損腦組織產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，研究顯示[3-4]，腦出血后血腫沖洗液中炎性細(xì)胞因子含量明顯增高，而且與腦水腫高峰相一致。腦組織損傷后星形細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞首先表達(dá)TNF-α[5]。崔潔等[6]研究顯示，腦出血后血漿中TNF-α的濃度出現(xiàn)了明顯的增高，隨著TNF-α含量的增高，腦水腫也隨之明顯加重，這也說明TNF-α是腦出血后腦水腫發(fā)生的重要因素之一。IL-1是促炎癥細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，可分為α、β、γ三種類型。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β與腦水腫關(guān)系密切，可介導(dǎo)血管內(nèi)皮通透性增加而加重腦水腫[7]。IL-6由促炎細(xì)胞因子IL-1和TNF-α刺激產(chǎn)生的，Taupin等[8]的動物實驗證實，腦出血早期IL-6明顯增高，而此時正是腦組織損傷、水腫和炎癥反應(yīng)的高峰期，表明IL-6參與了腦出血的繼發(fā)性腦損傷，IL-6還能激活補(bǔ)體系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞損害。因此，測定腦出血后腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量變化可以反映腦組織損傷的程度，可用于反映藥物治療后的效果，本研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸二胺治療組腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量較模型組明顯降低，腦水腫程度亦明顯減輕，說明甘草酸二胺可以抑制腦損傷后炎癥反應(yīng)，從而減輕腦水腫。

皮質(zhì)激素可改善血腦屏障的功能，降低毛細(xì)血管的通透性，減少腦脊液的生成，改善腦微循環(huán)，穩(wěn)定溶酶體膜等作用，故可用于腦水腫的治療，但因激素存在嚴(yán)重的副作用，限制了激素的應(yīng)用。甘草酸二胺是從中藥甘草有效成份的第三代提取物，其具有較強(qiáng)的抗炎、解毒、抗過敏、保護(hù)肝細(xì)胞膜和改善肝功能等作用，該藥在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與醛固酮的類固醇環(huán)相似，可阻礙可的松與醛固酮的滅活，從而發(fā)揮類固醇樣作用，而無皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)甘草酸二胺可以降低大鼠腦出血后腦組織中TNF-α、IL-1、IL-6的含量，減輕腦水腫，我們推測這可能與甘草酸二胺的皮質(zhì)激素樣作用有關(guān)。

雖然基礎(chǔ)研究顯示甘草酸二胺可以減輕大鼠腦出血后腦水腫，但在臨床上是否可以用于腦出血后腦水腫的治療尚有待進(jìn)一步研究。

[1]Rosenberg GA,Mun-Bryce S,Wesley M,et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J].Stroke,1990,21：801-807.

[2]王秀彬,曹和濤,李 敏,等.串聯(lián)線圈大鼠MR成像的初步應(yīng)用研究[J].中華放射學(xué)雜志,2010,44(9)：991-994.

[3]李 銀,李新軍.高血壓腦出血患者血腫沖洗液IL-1、IL-6及TNF-α含量的動態(tài)變化及意義[J].2008,28(2)：155-157.

[4]張明偉,彭 俊,劉 陽.高血壓腦出血患者血清和顱內(nèi)血腫液中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量研究[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2010,9(2)：138-141.

[5]Mayne M,Ni W,Yan HJ,et a1.Antisense oligodeoxynu-cleotide inhibition of tumor necrosis factor-α expression is neuroprotective after intracerebral hemorrhage[J].Stroke,2001,32(3)：240.

[6]崔 潔,王景周,宋 欽,等.腦出血大鼠腦水腫與血漿腫瘤壞死因子關(guān)系的研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2007,36(13)：1244-1245.

[7]Holmin S,Mathiese T.Intracerebral and adminstration of interleukin-1β and induction of inflammation,apoptosis and vasogenic edema[J].Journal of Neurosurgery,2000,92(1)：108-120.

[8]Taupin V,Toumond S,Serrano A,et al.Increase in IL-6,IL-1 and TNF-α levels in rat brain following traumatic lesion influence of pre-and post-traumatic treatment with Ro5 4864,a peripheral-type(psite)benzodiazepine ligand[J].Journal of Neuroimmunology,1993,42(2)：177-185.