HMGB1、VEGF和MMP-7的相關性及其與結直腸癌侵襲轉移關系

史振軍，馬海芝，楊振淮，邱萬壽

（1.廣州中醫藥大學附屬市中醫院普外科，廣東 廣州 510130；2.中山大學附屬第三醫院普外科，廣東 廣州 510635）

高遷移率族蛋白1(High mobility group box-1，HMGB1)在多種腫瘤中過度表達，其水平遠高于相對應的正常組織，且可能與腫瘤的發生、發展、病灶大小、浸潤及淋巴結轉移有關[1]。血管內皮生長因子(VEGF)與腫瘤血管生成密切相關,是促進腫瘤血管生成的眾多因子中最重要的一種。基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)可融解細胞外基質，促進腫瘤侵襲轉移。我們用免疫組化方法檢測人結直腸癌組織中HMGB1、VEGF、及MMP-7表達情況,以探討三者在結直腸癌中的相關性及其與結直腸癌侵襲轉移關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2001年1月至2010年10月在廣州中醫藥大學附屬廣州市中醫院普外科病理診斷為結直腸癌的腫瘤組織70例、癌旁組織20例及內鏡室正常黏膜組織20例。70例結直腸癌患者中，男性46例(46.9%)，女性24例(53.1%)；年齡最大76歲，最小29歲，中位年齡56歲，其中＜60歲33例，≥60歲37例；腫瘤直徑＜5 cm 34例，≥5 cm 36例；肝轉移20例；高分化27例，中低分化腺癌39例，黏液腺癌2例，管狀腺癌1例，腺瘤癌變1例；浸潤深度達肌層22例，漿膜及漿膜外48例；根據UICC 2002年分期標準分期，Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～IV期36例；結腸癌37例，直腸癌33例。其他兩組一般資料與結直腸癌組比較差異無統計學意義，有可比性。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人HMGB1單克隆抗體、羊抗人MMP-7單克隆抗體SP試劑盒均購于北京中杉生物公司。微波爐(Leica公司)、復溫箱(Leica公司)、Leica1203型切片機(Leica公司)、Olympus顯微照相系統(日本Olympus公司)、Leica1220 型烤箱(Leica公司)、Olympus BH2光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 免疫組織化學 全部臘塊4 μm厚連續切片4張，用EnVision兩步法，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染、封片。免疫組化結果判斷標準：免疫組化染色陽性反應為細胞漿或胞核中出現淡黃色至棕褐色顆粒。參考Kawasaki等[2]報道的方法，根據染色的強度及陽性細胞的面積判斷結果。每張切片陽性細胞的染色強度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分為四個等級。每張切片選擇有代表性的區域，以細胞內出現棕黃色面積＞20%為陽性，在200倍視野下進行計數共計5個視野，取其平均值避免隨意性。VEGF蛋白陽性染色定位于細胞胞漿(呈棕黃色顆粒)；HMGB1蛋白陽性染色定位于細胞質(呈棕黃色顆粒)；MMP-7蛋白表達于細胞質和胞膜上(呈棕黃色或淺棕色顆粒)。

1.4 統計學方法 本實驗數據經檢驗符合正態分布。結果用SPSS13.0統計包裝軟件進行分析處理。根據數據特征進行χ2檢驗、列聯表的關聯性分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

本實驗所有免疫組化切片均由兩名病理科主治醫師雙盲法讀片，差異出現5%～10%，然后共同決定診斷。

2.1 HMGB1、VEGF、MMP-7 在結直腸正常組織、癌旁組織及結直腸癌中的表達 在正常組織中VEGF、MMP-7不表達，HMGB1僅1例表達；在結直腸癌組織中高表達，分別為50例、52例、46例，在癌旁組織中低度表達，分別為6例、7例、4例。3項指標各組比較差異具有統計學意義(均P＜0.05)，見表1。

表1 HGM1、VEGF、MMP-7在結直腸正常組織、癌旁組織及結直腸癌中的表達[例（%）]

2.2 結直腸癌組織中VEGF、HMGB1、MMP-7的表達量與臨床指標的關系 VEGF、HMGB1、MMP-7的表達與患者腫瘤部位、性別、年齡、腫瘤直徑大小無關，而與腫瘤的浸潤深度、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、肝轉移有關，并且隨著腫瘤的惡化程度、轉移其表達呈遞增性，說明三項指標與結直腸癌侵襲轉移密切相關，見表2。

表2 結直腸癌組織中VEGF、HMGB1、MMP-7的表達量與臨床指標關系[例（%）]

2.3 VEGF、HMGB1、MMP-7在結直腸癌侵襲轉移中的相關性 經列聯表的關聯性分析HMGB1、MMP-7、VEGF在結直腸癌的表達均具有顯著相關性(P＜0.01)。關聯系數均大于0.6，說明三者具有較強的正相關性，協同促進了腫瘤的發生和發展，見表3。

表3 VEGF、HMGB1、MMP-7在結直腸癌侵襲轉移中的相關性

3 討 論

腫瘤的發生和發展是一個多階段、多基因參與的復雜過程。有學者提出多基因協同學說，認為在腫瘤發生發展的各個階段至少有兩個及以上功能不同的異常激活的癌基因各自發揮著不同的作用，并在時間與空間上相互配合，協同促進了細胞的癌變和轉移。

現已公認，新生的微血管是腫瘤侵襲轉移的第一站，隨著腫瘤微血管計數(MVD)的增加，腫瘤侵襲轉移的危險潛能也明顯增加，腫瘤微血管生成是腫瘤生長和轉移的必要條件，而血管內皮細胞生長因子在血管新生過程中起了至關重要的作用。VEGF是血管生成過程最重要的正向調控因子,與多種腫瘤的生長、轉移和預后密切相關[3]。研究表明HMGB1在正常組織中很少表達，在組織損傷、炎癥、腫瘤等情況下表達增強，可能參與腫瘤的增殖、侵襲、分化及凋亡等，說明與惡性腫瘤的形成和發展相關[4]。腫瘤細胞的侵襲轉移必須穿越組織自然屏障向遠離原發瘤部位移動，細胞間基質和基底膜組成的細胞外基質對防御腫瘤的侵襲和轉移具有重要作用，細胞外基質是腫瘤侵襲和轉移的天然屏障，基質溶解必然會促進腫瘤的侵襲轉移。有人認為MMP-7是腫瘤侵襲轉移過程中最直接、最重要的金屬蛋白酶[5]，同時可促進腫瘤血管的生長，在小血管、毛細血管末梢形成及血管內皮基膜形成的過程中起重要作用。

本研究中：在20例結直腸正常黏膜標本中VEGF、MMP-7不顯示；在20例結直腸癌旁組織VEGF、HMGB1及MMP-7陽性表達分別為6例、7例、4例，表達率分別為30%、35%、20%。而在惡性腫瘤中三項指標陽性表達分別50例、52例、46例，表達率分別為71.4%、74.3%、65.7%。結直腸癌組織與癌旁組織、正常組織差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。所測結果高于國外相關報道，可能與我們所取研究對象多為進展期有關。同時本研究還發現VEGF、HMGB1及MMP-7在結直腸癌組織中的表達與患者的年齡、性別、腫瘤直徑大小、腫瘤部位無關(P＞0.05)，而與腫瘤的浸潤深度、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、肝轉移有關(P＜0.05)，并且隨著腫瘤惡性程度、TME分期等的進展，其陽性表達呈遞增性。

經列聯表的關聯性分析我們發現：HMGB1、MMP-7、VEGF在結直腸癌的表達均具有顯著相關性(P＜0.01)，其關聯系數I值均大于0.6，說明三者具有較強的正相關性，VEGF、MMP-7的蛋白表達與HMGB1的強表達明顯相關。

因此，筆者認為：HMGB1、MMP-7、VEGF三者具有正相關性，相互影響，促進了腫瘤的發生、發展，與結直腸癌的侵襲轉移密切相關，而HMGB1可能通過誘導VEGF、MMP-7的表達而促進結直腸癌腫瘤新生血管生成和侵襲轉移，但具體機制尚不清楚。因此，HMGB1、VEGF、MMP-7的聯合檢測對結直腸癌的病理分期、預后判斷及指導臨床治療具有重要意義，可作為較為可靠的聯合檢測指標。

[1]Moe SE,Sorbo JG,Sogaard R,et al.New isoforns ofrat Aquaporin-4[J].Cenomics,2008,91(4)：367-377.

[2]Kawasaki H,Altieri DC,Lu CD.Inhibition of apoptosis by surviving predicts shorter survival rates in colorectal cancer[J].Cancer Res,1998,58：5071.

[3]Shimanuki Y,Takahashi K,Cui R,et al.Role of serum vascular endothelial growth factor in the p rediction of angiogenesis and prognosis for non-small cell lung cancer[J].Lung,2005,183(1)：29-42.

[4]Xiang YY,Wang DY,Tanaka M,et al.Expression of high-mobility group-1 mRNA in human gastrointestinal adenocarcinoma and corresponding non-cancerous mucosa[J].Int J Cancer,1997,74(1)：1-6.

[5]Loukopoulos P,Mungall BA,Straw RC,et al.Matrix metalloproteinases-2 and-9 involvement in canine tumors[J].Vet pathol,2003,40(4)：382-394.