蛇床組織培養及無性系的建立

趙丹琦，黃光霽，高弘揚，徐 娜，姜長陽

（遼寧師范大學生命科學學院，遼寧大連 116081）

蛇床（Cnidium monnieri）屬于傘形科蛇床屬一年生草本植物，生長于原野、河邊、路旁濕地和山坡草地，分布于我國的很多地區[1-2]。蛇床籽含環葑烯、月桂烯、異龍腦等成分[3]，作為中藥用，具有溫腎壯陽、燥濕殺蟲、祛風止癢等功效，能治男子陽痿、女子宮寒不孕、濕痹腰疼、寒濕帶下、陰囊濕癢、風濕痹疼、濕瘡、疥癬等疾病[3]。由于其具有重要的藥用價值，市場上出售價格很高。為此，多年來遼寧南部地區的人們一直在大量采收蛇床以藥用或出售，使野生蛇床的繁殖遭到嚴重破壞，導致近年來遼南地區難以見到這種植物（接近瀕危的狀態）。有人試圖對其進行栽培，但本來就很有限的種子，其發芽率又很低，使其難以實現人工栽培。目前已有植物組織培養研究的報道[4-6]以及蛇床愈傷組織研究的初步報道[7-8]，但迄今未見蛇床組織培養及無性系建立的報道。

為了保護這種野生植物，實現人工栽培，本試驗對蛇床進行了愈傷組織培養及無性系建立的研究。

1 材料和方法

1.1 材料及滅菌

2007年6月上旬把生長于大連市甘井子區山坡濕地上的蛇床植株采回實驗室，作為試驗材料。其嫩莖滅菌參照高迎秋等[9]的方法進行。

1.2 培養條件

MS，1/2 MS，1/4 MS，B5，N6，LS 和 White 為次基本培養基，附加不同種類及質量濃度的細胞分裂素和生長素；愈傷組織誘導和不定芽分化培養基含蔗糖30 g/L，生根培養基為15 g/L；pH值為5.8～6.0；培養溫度25℃左右；固體培養基的胨力強度為200 g/L；芽和根的誘導培養均于光照條件下進行，光照時間為10～12 h/d，光照強度為3 000 lx 左右[9]。

1.3 方法

1.3.1 愈傷組織誘導 將嫩莖、嫩根和嫩葉柄分別切成長0.3 cm左右的莖段、根段和葉柄段，將葉片切成邊長為0.3 cm左右的塊狀后，分別平放接種到 MS＋6－BA0.2 mg/L＋2，4－D1.5 mg/L＋NAA 0.5 mg/L的培養基上，進行不同材料對愈傷組織誘導培養的試驗。試驗重復3次，每種處理接種200個材料。

1.3.2 愈傷組織的分化 把在培養基MS＋6－BA 0.2 mg/L＋2，4－D 1.5 mg/L＋NAA 0.5 mg/L培養基上繼代培養的愈傷組織切成直徑0.3 cm左右、由4～9個顆粒組成的愈傷組織塊后，接種到分別以 MS，1/2 MS，1/4 MS，B5，N6，LS 和 White 為基本培養基，附加AgNO31.2 mg/L＋6－BA0.8 mg/L＋NAA 0.1 mg/L＋GA30.5 mg/L培養基上，進行不同基本培養基對愈傷組織分化培養影響的試驗。試驗重復3次，每處理接種100個材料。

1.3.3 不定芽生根培養 將1.3.2繼代分化培養的不定芽從基部剪下，接種到以White＋IBA 0.1 mg/L和1/3 MS＋IBA 0.1 mg/L為基本培養基，附加不同濃度IAA，NAA的生根培養基上進行生根培養。生根培養試驗重復2次，每種培養基接種100個不定芽。

1.3.4 試管苗移栽與定植 打開培養著生根試管苗培養瓶瓶塞，置于溫室的光照下煉苗2 d，將試管苗取出，洗凈根部培養基后，移栽到上半部為干凈河沙、下半部為肥沃園土的營養缽中。試管苗移栽試驗重復2次，每次移栽600株。

把營養缽中移栽成活的試管苗于2009年5月中旬定植到大連郊區的草地上。試驗重復2次，每次定植550株。

2 結果與分析

2.1 不同材料對愈傷組織誘導培養的影響

接種培養50 d后進行觀察統計，結果列于表1。由表1可知，葉片和根不能誘導形成愈傷組織，葉柄和嫩莖能誘導形成愈傷組織。其中，嫩莖的誘導效果好于葉柄，不僅誘導率為83.0%，而且誘導的愈傷組織長勢好。觀察表明，以嫩莖為培養材料，接種10 d時可見部分材料切口膨大，開始形成愈傷組織。之后，隨著形成愈傷組織嫩莖段的數量增加，形成的愈傷組織也不斷生長，有的在嫩莖一端生長為半球形，有的兩端同時生長，形成啞鈴狀。初期形成的愈傷組織為淡黃色且表面光滑，后期生長為嫩綠色，表面為顆粒狀，一般認為，這樣的愈傷組織為具有分化能力的愈傷組織[10-11]。以嫩莖為培養材料，另外2次重復試驗誘導培養的愈傷組織也長勢旺盛，其愈傷組織的誘導率分別為85.5%和82.0%。

表1 不同材料對愈傷組織誘導的影響

把以上由嫩莖誘導培養的愈傷組織切割成直徑0.3 cm左右、由4～9個顆粒組成的愈傷組織塊后，接種到相同的培養基上，進行愈傷組織的繼代增殖培養，每次重復試驗繼代培養5代。結果表明，經過40 d的培養，就又會培養生長出一代生長旺盛、顏色嫩綠、表面由許多顆粒組成、具有分化能力、平均增殖系數為7.6的愈傷組織。結果得出，MS＋6－BA 0.2 mg/L＋2，4－D 1.5 mg/L＋NAA 0.5 mg/L的培養基是蛇床嫩莖愈傷組織誘導培養和繼代培養的理想培養基。

2.2 不同培養基對愈傷組織分化培養的影響

接種培養50 d觀察統計結果（表2）表明，在以MS，1/2 MS和White為基本培養基的3種培養基上，愈傷組織能分化。其中，在以1/2 MS為基本培養基的培養基上統計觀察的4項指標效果最好。觀察表明，在以1/2 MS為基本培養基的培養基上，培養到8 d時，可見愈傷組織塊的上部開始分化生長出綠色不定芽點。之后，伴隨著不定芽點的生長，在其下部周圍又會分化生長出多個芽點。培養到50 d時，就又能分化生長出一個不定芽叢。3次重復試驗的結果基本相同。把由愈傷組織分化培養的不定芽從基部切下，接種到與愈傷組織分化培養相同的培養基上，進行不定芽的分化繼代增殖培養。3次重復試驗，每次分化繼代培養5代結果表明，經過40 d的培養，就會分化生長出一代長勢幾乎與由愈傷組織分化培養完全相同的試管苗，平均每代的繁殖系數為4.6。按照這個速度，每年能繁殖出4.69個不定芽（約為92萬個不定芽）。除掉各種不利因素的影響，1 a能保證繁殖50萬個不定芽。結果得出，1/2 MS＋AgNO31.2 mg/L＋6－BA 0.8 mg/L＋NAA 0.1 mg/L＋GA30.5 mg/L為蛇床愈傷組織進行分化培養和不定芽分化繼代增殖培養的理想培養基。

表2 不同基本培養基對愈傷組織分化培養的影響

2.3 不同質量濃度的NAA，IAA對不定芽生根的影響

培養26 d時觀察進行統計結果（表3）表明，不定芽在附加不同質量濃度IAA和NAA的生根培養基中均能誘導生根，其中，附加IAA好于NAA。在附加IAA為0.2 mg/L的培養基上生根效果最好，不僅生根率為94%，而且試管苗生長旺盛。觀察表明，把不定芽接種到附加質量濃度為0.2 mg/LIAA的培養基上，培養4 d可生長出根原基。之后，伴隨著根的伸長生長，根數也不斷增加。培養到26 d時，就會培養生長出株高4 cm左右、約有5個葉片、外觀上生長旺盛的試管苗。2次生根培養重復試驗的結果基本相同。結果得出，White＋IBA 0.1 mg/L＋IAA 0.2 mg/L為蛇床不定芽生根培養的理想培養基。

表3 不同質量濃度NAA，IAA對不定芽生根培養的影響

2.4 試管苗移栽與定植

移栽和定植后30 d統計表明，2次移栽的平均成活率為95.3%。在日光溫室中試管苗易移栽成活。2次定植的平均成活率為99.3%。在營養缽中移栽成活的試管苗極易定植成活。觀察表明，定植后50 d左右，成活的試管苗開始旺盛生長。定植90 d后的試管苗與野生蛇床相比，特點為：群體生長整齊，葉色濃綠，根系發達，花期延長20 d左右，保持了野生蛇床的所有植物學性狀。

3 討論

采用不定芽分化繼代增殖培養的方法，1 a能保證繁殖出50萬株試管苗，這個繁殖速度能滿足人們栽培對蛇床種苗的需求。而定植后的試管苗保持了野生蛇床所有植物學性狀的結果，又進一步證明了該研究所建立的蛇床無性系，為野生蛇床的保護和滿足人們對種苗的需求奠定了技術基礎。

在本研究的愈傷組織誘導培養階段，培養周期為50 d，而在愈傷組織的繼代培養階段，培養周期為40 d，后者比前者縮短了10 d。產生這種現象是由幾個方面的原因引起的：一是前者采用的是經過滅菌的外植體，這種材料在滅菌過程中受到了滅菌劑的傷害，在進行愈傷組織的誘導培養中，要經過一個恢復培養階段，因此，培養時間延長。二是前者所使用的嫩莖是已經分化的植物組織，脫分化過程需要一定的時間，而后者是即將脫分化并處在旺盛生長中的組織，不需要脫分化的時間。三是前者是外植體，接種到培養基上后，必然出現一個適應過程，而后者是直接來自培養基上的材料，不需要這個適應過程。

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