轉耐鹽基因GhNHX1棉花株系耐鹽性初步鑒定

吳 霞，吳長艾，上官小霞，馬燕斌，翟曉菊，李燕娥

（1.山西省農業科學院棉花研究所，山西運城 044000；2.山東農業大學生命科學學院，山東泰安 271018）

我國鹽堿土壤的分布區域廣闊，總面積為0.33多億hm2，其中占耕地總面積10%以上的0.13多億hm2具有農業利用潛力。隨著生態環境的惡化，土壤呈現沙漠化、鹽堿化的趨勢逐年加重，全球鹽堿地每年增加100萬～150萬hm2。為此，利用生物技術改造植物，應用分子育種改良作物耐鹽抗逆性狀，培育作物耐鹽抗逆新品種尤為重要。目前，國內不同單位相繼開展了玉米、水稻、小麥等作物的耐鹽性研究[1-4]。另外，棉花是鹽堿地種植的主要作物之一，轉基因耐鹽堿棉花的培育是“十一五”轉基因重大專項研究內容重點之一。

本研究通過生物技術導入棉花耐鹽性基因GhNHX1，旨在使其過量表達來提高棉花植株的耐鹽能力。

1 材料和方法

1.1 材料

轉基因受體與對照均為陸地棉棉花品系R15，4092為利用農桿菌介導法[5-6]轉化外源陸地棉耐鹽基因GhNHX1獲得的純合棉花株系，其中，GhNHX1基因編碼543個氨基酸。

1.2 抗性檢測方法

1.2.1 轉基因GhNHX1棉花種子不同鹽含量發芽試驗 NaCl設置5個不同含量梯度：0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，每個處理分別為40粒種子。種子用15%H2O2滅菌2～3 h，無菌水洗2～3次。在不同鹽含量浸種24，48 h后，觀察種子的萌發狀況。

1.2.2 轉基因GhNHX1棉花種子不同鹽含量培養基耐鹽性檢測 所有試驗棉花種子經15%H2O2滅菌2～3 h后，用無菌水洗2～3次。鹽含量為0的無菌水浸種24 h后，取發芽好的種子種入鹽含量為2.0%的1/2 MS種苗培養基中，5 d（120 h）后稱量統計棉花苗生物鮮質量。

1.2.3 轉基因GhNHX1棉花種子在不同鹽含量盆栽耐鹽性檢測 土壤晾干后加入5個不同NaCl含量的培養基中，鹽含量梯度同1.2.1。然后在這一梯度下分別播種4092與對照R15棉花種子，統計出苗率。

2 結果與分析

2.1 轉基因GhNHX1棉花種子發芽的耐鹽性檢測

從表1可以看出，在無NaCl的無菌水中浸種24，48 h后，對照R15與4092發芽率均能達到100%。當增加NaCl含量到0.5%浸種24 h時，對照R15

發芽率降到37.5%，而轉基因株系4092發芽率仍為100%；增加浸種時間到48 h，對照R15發芽率增加到85%，而轉基因株系4092發芽率仍為100%。當鹽含量增加到1.0%，浸種24 h時，對照R15發芽率降到7.5%，而轉基因株系4092發芽率為65%；增加浸種時間到48 h，對照R15發芽率增加到60%，而轉基因株系4092發芽率為90%。當鹽含量增加到1.5%，浸種24 h時，對照R15發芽率降到0，而轉基因株系4092發芽率為12.5%；增加浸種時間到48 h，對照R15發芽率增加到10%，而轉基因株系4092發芽率為20%。但當鹽含量增加到2.0%時，經過24，48 h處理，對照與4092均不能正常發芽。結果表明，對照R15和轉基因棉花的發芽率明顯受鹽含量高低的影響，隨著鹽含量梯度的增加，對照與轉基因株系4092的發芽率均受到不同程度抑制，但是轉基因株系4092的耐鹽性明顯增強。

表1 不同鹽含量梯度條件下棉花種子的發芽率 %

2.2 不同鹽含量下轉基因GhNHX1棉花幼苗的生物鮮質量

對轉基因GhNHX1棉花幼苗在不同鹽含量條件下的耐鹽性生長進行了研究，分別稱量統計鹽含量2.0%培養基中生長5 d的棉花幼苗鮮質量。從表2可以看出，轉基因株系4092棉花幼苗（10株）的鮮質量明顯高于對照，其中，總質量及下胚軸、葉、根質量分別比對照增加0.830，0.305，0.302，0.223 g。說明轉基因株系4092在含鹽量較高的環境中生物鮮質量比對照有較高的增加，生活力得到明顯提高，耐鹽性生長得到較好的改良。

表2 轉耐鹽基因棉苗不同組織在鹽含量2.0%時的生物鮮質量 g/10株

2.3 不同鹽含量下轉基因GhNHX1棉花盆栽的出苗率

轉基因GhNHX1棉花種子在室內培養基中耐鹽性較好，為證實在田間鹽堿地中種子的耐鹽性和發芽率是否受影響，特利用含鹽土壤盆栽試驗，對棉花幼苗的出苗概況進行初步統計分析。由表3可知，轉基因GhNHX1棉花種子與對照R15在含鹽量為0的土壤中出苗率均為100%；在鹽含量為0.5%的土壤中，轉基因株系4092比對照出苗率提高13.3百分點。而在鹽含量為1.0%的土壤中，轉基因株系4092比對照出苗率提高3.7百分點。在鹽含量為1.5%的土壤中，轉基因株系4092比對照出苗率提高6.6百分點。說明轉GhNHX1基因的4092株系耐鹽性得到了較大提高。

表3 不同鹽含量下轉基因GhNHX1棉花盆栽出苗率 %

3 結論與討論

在已有耐鹽性研究的報道中，鹽脅迫可延遲水稻種子的萌芽和出苗，常會導致種子發芽不齊，發芽率降低[7]。此外，除GhNHX1基因外，棉花中也存在其他與鹽脅迫的相關基因，說明棉花耐鹽性可能與多個基因相關[7-8]。從本研究不同鹽含量梯度的種子發芽率來看，在0.5%～1.5%的鹽含量條件下，浸種24 h時，轉基因株系4092的發芽率分別比對照高出62.5，57.5，12.5百分點。浸種48 h時，其發芽率分別比對照高出15，30，10百分點。通過對轉基因株系4092的生物鮮質量和土壤盆栽出苗率統計分析，得出轉基因株系與對照R15相比，生物鮮質量與出苗率均優于對照，耐鹽性具有明顯的提高。從本研究結果來看，鹽分對棉花生長發育的抑制在棉花種子吸水萌發和苗期生長階段比較嚴重，在預先通過正常浸種發芽后，其后期出苗率和苗期生長受到的影響較大。本研究說明，轉外源基因GhNHX1有助于改良棉花的耐鹽性，該基因的RNA表達分析、蛋白表達以及相關的生理生化變化還有待進一步研究。

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