轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米對(duì)大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響

屈 靜，宋 鑫，雁平梅，閻小艷，高晉華

（太原師范學(xué)院生物系，山西太原 030031）

玉米不僅是重要的糧食作物，而且是重要的飼料作物，其在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有非常重要的地位，因而，玉米基因轉(zhuǎn)化研究也是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一[1]。玉米矮花葉病是世界上廣泛發(fā)生、為害嚴(yán)重的玉米病毒性病害，嚴(yán)重影響著玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。玉米矮花葉病毒（Maize dwarfmosaic virus，MDMV）侵染禾本科植物，會(huì)引起玉米、高粱發(fā)生嚴(yán)重的病害。玉米感染MDMV后，普通玉米單株會(huì)減產(chǎn)42%，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大損失[3]。轉(zhuǎn)基因玉米是排在轉(zhuǎn)基因大豆之后的第2位主要生物技術(shù)作物[4]。而且應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可提高玉米對(duì)玉米螟、食根害蟲以及除草劑的抗性，彌補(bǔ)了玉米遺傳改良中傳統(tǒng)育種方法的局限[5]。孫毅教授課題組采用花粉介導(dǎo)的方法，將RDV運(yùn)動(dòng)蛋白缺陷型基因（RDV MP-基因）導(dǎo)入玉米自交系478中，最終篩選到轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米純合株系[6]。目前，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米安全性評(píng)價(jià)主要集中于抗蟲、抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米的研究，而對(duì)轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米的安全評(píng)價(jià)涉及較少。

本研究應(yīng)用2代生殖毒性試驗(yàn)，觀察轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米對(duì)大鼠F2生長(zhǎng)發(fā)育及雄性生殖器官組織結(jié)構(gòu)的影響，以評(píng)價(jià)多代飼喂轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米對(duì)大鼠健康和生長(zhǎng)發(fā)育的長(zhǎng)期影響。

1 材料和方法

1.1 材料

健康斷乳SD大鼠雌雄各40只，體質(zhì)量為110～130 g，由山西醫(yī)科大學(xué)提供。試驗(yàn)用轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心孫毅教授惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物繁殖 斷乳SD大鼠（F0）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組雌雄各20只，對(duì)照組（C1）飼喂含有33%普通玉米的全營(yíng)養(yǎng)飼料，試驗(yàn)組（M1）飼喂含有33%轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米的全營(yíng)養(yǎng)飼料，期間均自由飲水和進(jìn)食。對(duì)照組和試驗(yàn)組分別飼喂飼料60 d之后，各組按雌、雄1∶1交配，F(xiàn)1仔鼠斷乳后雌雄分籠飼養(yǎng)，繼續(xù)給予與親本（F0）相同飼料，繁殖傳至2代（F2），飼喂受試飼料至出生后60 d。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法 在F2仔鼠出生后第1天記錄初生仔鼠體質(zhì)量、性別比，于出生后第4天、第21天分別計(jì)算仔鼠出生成活率和哺育成活率。出生后第3天至10周齡，按文獻(xiàn)[7-8]的方法觀察記錄194只仔鼠的各項(xiàng)生長(zhǎng)發(fā)育和早期神經(jīng)行為發(fā)育指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)組及對(duì)照組的達(dá)標(biāo)率。

F2雄鼠生長(zhǎng)至60 d后，各組隨機(jī)選擇20只斷頸處死，分別取出兩側(cè)睪丸及附睪，稱質(zhì)量。取右側(cè)睪丸及附睪用10%甲醛固定，采用常規(guī)組織制片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸和附睪結(jié)構(gòu)，同時(shí)測(cè)量60個(gè)視野各級(jí)生精細(xì)胞的直徑，以及附睪管壁厚度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，仔鼠成活率和生理指標(biāo)采用獨(dú)立性檢驗(yàn)，其他采用t檢驗(yàn)（P＜0.05為差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 F2仔鼠出生體質(zhì)量、出生性別比及存活率

F2仔鼠出生時(shí)平均體質(zhì)量、出生性別比以及出生成活率和哺育成活率結(jié)果列于表1。檢驗(yàn)表明，體質(zhì)量、性別比沒(méi)有差異，飼喂轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米組出生成活率與哺育成活率分別比對(duì)照組高8.2百分點(diǎn)和3.6百分點(diǎn)，但影響沒(méi)有超出生物學(xué)顯著范圍（P＞0.05）。

表1 F2仔鼠出生體質(zhì)量、出生性別比及存活率

2.2 F2仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育檢測(cè)結(jié)果

表2顯示，飼喂含33%轉(zhuǎn)基因玉米飼料的仔鼠與飼喂含33%非轉(zhuǎn)基因玉米飼料的仔鼠相比，生長(zhǎng)發(fā)育各指標(biāo)沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。

表2 F2仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)達(dá)標(biāo)率比較 %

觀察記錄的F2早期神經(jīng)行為發(fā)育指標(biāo)達(dá)標(biāo)率結(jié)果如表3所示。運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力如爬行、抓桿、平面翻正和空中翻正以及神經(jīng)反射行為，試驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)意義上差異。

表3 F2仔鼠早期神經(jīng)行為發(fā)育指標(biāo)達(dá)標(biāo)率比較 %

2.3 F2雄鼠生殖器官的組織結(jié)構(gòu)

解剖觀察睪丸及附屬器官的外觀、色澤、充血與出血情況未見(jiàn)異常。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組雄鼠的睪丸組織與對(duì)照組相比，各級(jí)生精細(xì)胞界限明顯，排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，附睪管上皮腔面平整，平滑肌豐厚，均未見(jiàn)結(jié)構(gòu)異常。

表4 F2雄鼠睪丸、附睪質(zhì)量比較及組織形態(tài)學(xué)比較

從表4可以看出，飼喂含有33%轉(zhuǎn)基因玉米的F2雄性大鼠睪丸質(zhì)量及附睪質(zhì)量同對(duì)照組相比，沒(méi)有明顯差異（P＞0.05），分別比較2組睪丸中精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞和精細(xì)胞的直徑以及附睪管壁的厚度，發(fā)現(xiàn)其差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

目前，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物安全性所遵循的是實(shí)質(zhì)等同性原則（substantial equivalence）[9]。將待評(píng)價(jià)的轉(zhuǎn)基因食品與現(xiàn)存的傳統(tǒng)同類食品相比較，以確定這種新食品與非轉(zhuǎn)基因品種在有益健康方面的相似性[10]，而動(dòng)物飼喂試驗(yàn)是明確轉(zhuǎn)基因作物營(yíng)養(yǎng)成分實(shí)質(zhì)等同性的一個(gè)重要部分[11]。吳凱晉[12]進(jìn)行的90 d全食物飼喂試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米與飼喂傳統(tǒng)玉米相比，大鼠各周累積體質(zhì)量以及各臟器系數(shù)沒(méi)有顯著差異。但轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米對(duì)子代影響目前沒(méi)有明確數(shù)據(jù)。通過(guò)本試驗(yàn)研究可知，試驗(yàn)組F2仔鼠的出生體質(zhì)量、幼體存活率與對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異，表明轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米未對(duì)動(dòng)物繁殖及繁殖行為產(chǎn)生影響。

神經(jīng)行為學(xué)的變化是一種早期和敏感的毒理學(xué)指標(biāo)，可能引起后代在組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不可逆的損害之前，表現(xiàn)出行為功能的障礙[13-15]。Kilic[4]研究表明，3代喂養(yǎng)食物中添加20%轉(zhuǎn)Bt基因玉米并未對(duì)F1，F(xiàn)2和F3大鼠的神經(jīng)行為產(chǎn)生有害影響。本試驗(yàn)期間沒(méi)有觀察到F0，F(xiàn)1和F2大鼠行為、姿勢(shì)及外形的異常；對(duì)F2仔鼠早期各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)檢測(cè)后得出，飼喂轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)、運(yùn)動(dòng)和協(xié)調(diào)指標(biāo)均無(wú)明顯影響，且2組仔鼠合格率均較高。

睪丸和附睪的結(jié)構(gòu)及微環(huán)境對(duì)于精子生長(zhǎng)、發(fā)育和成熟以及功能完成至關(guān)重要[15]，而哺乳動(dòng)物睪丸組織高速的細(xì)胞增殖和獨(dú)特的細(xì)胞分化，使其成為敏感檢測(cè)細(xì)胞和分子變化的器官[16]。Polat對(duì)2代飼喂轉(zhuǎn)Bt基因玉米試驗(yàn)的結(jié)果表明，大鼠雄性及雌性生殖器官?zèng)]有明顯組織病理學(xué)方面的差異[3]。Poulsen等[17]的轉(zhuǎn)基因水稻90 d飼喂試驗(yàn)顯示，Wistar大鼠睪丸、附睪的質(zhì)量以及組織結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生改變。本試驗(yàn)得出同樣的結(jié)果，F(xiàn)2雄性大鼠睪丸及附睪組織沒(méi)有觀察到與試驗(yàn)處理相關(guān)的肉眼可見(jiàn)的病變，光鏡下觀察可見(jiàn)睪丸組織曲細(xì)精管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，說(shuō)明有正常的生精過(guò)程。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，中長(zhǎng)期飼喂轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米，對(duì)大鼠F0，F(xiàn)1的繁殖功能、繁殖行為未造成有害影響，F(xiàn)2早期生長(zhǎng)發(fā)育各參數(shù)、雄性生殖器官質(zhì)量和組織結(jié)構(gòu)均未檢測(cè)到異常，其結(jié)果可與其他結(jié)果相互驗(yàn)證，表明轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米與常規(guī)非轉(zhuǎn)基因玉米具有相同的營(yíng)養(yǎng)等價(jià)性。今后可考慮采用其他動(dòng)物開(kāi)展長(zhǎng)期飼喂試驗(yàn)，以進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)基因抗矮花葉病玉米對(duì)人體的安全性。

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