辣椒棗試管苗葉片再生植株研究

肖 蓉，王國平，李春燕，張擁兵

（山西省農業科學院果樹研究所，山西太谷 030815）

棗樹全身是寶，是我國重要的經濟樹種之一。針對棗特有的花蕾小、去雄困難及胚敗育嚴重等特點，利用現代生物技術，加速培育優良棗新品種意義非凡。而在現代生物技術的研究與應用中，離體葉片再生技術是果樹細胞水平的誘變育種、變異篩選、嵌合體分離及基因轉移等方面的基礎[1-2]。因此，對不同基因型的棗品種建立高效穩定的棗葉片再生體系在棗育種中尤為重要。由相關文獻報道可知，科研工作者已建立了民勤小棗[3]、梨棗[4]、沾化冬棗[5]、駿棗[6]、雞心棗[7]等棗品種的葉片再生體系，但還未見關于辣椒棗葉片再生的報道。

本試驗在前人研究的基礎上，以辣椒棗為試材，對影響其葉片再生的一些因素進行研究，旨在確定辣椒棗葉片再生的最佳條件，建立高效穩定的辣椒棗葉片再生體系。

1 材料和方法

1.1 材料

外植體：辣椒棗試管苗葉片，苗齡35 d，采自山西省農業科學院果樹研究所果樹生物技術研究室。

培養基：1/2 MS（大）、MS和WPM共3種基本培養基，并附加不同濃度的TDZ，IBA和糖。

1.2 方法

1.2.1試驗設計研究選用L9（34）設計，進行4因素3水平的正交試驗。查閱相關文獻資料，確定基本培養基種類、植物生長調節劑TDZ和IBA、糖4個參試因素，每個因素3水平，研究分析不同因素在不同水平條件下對辣椒棗試管苗葉片再生植株的影響（表1）。

表1 正交試驗因素水平

1.2.2 試驗方法 剪取辣椒棗試管苗從葉尖往下數的第3，4，5片葉子，在葉上垂直于葉脈方向用手術刀劃傷，然后接種于培養基上。每瓶放置6片葉，其中，3片葉片正面接觸培養基（反放），另外3片葉片背面接觸培養基（正放）。試驗共9組培養基，每組培養基分裝10瓶，其中，5瓶在溫度為（25±2）℃的培養室內先暗培養14 d，再在光照12～16 h/d，光照強度3 000 lx左右，濕度為60%～70%的培養室內培養；另外5瓶則不經過暗培養，直接在光下培養。培養28 d后調查出愈情況和褐化情況，并將外植體轉入MS＋IBA 0.1 mg/L＋GA30.05 mg/L培養基內誘導不定芽再生；培養60 d后調查不定芽再生數。試驗重復5次。

1.3 數據統計

出愈率＝（分化愈傷葉塊數/接入葉塊數）×100%；

褐化率＝（褐化葉塊數/接入葉塊數）×100%；

平均每葉塊不定芽再生數＝再生芽總數/接入葉塊數。

采用DPS統計軟件對數據進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同培養方式對葉片再生的影響

觀察發現，先暗培養、再光培養處理的葉片在經過14 d的暗培養后，生成的白色愈傷明顯多于直接光培養處理的葉片。暗處理的葉片整體顏色發白，而光處理的葉片整體顯綠（圖1，2）。隨著培養時間的延長，白色愈傷逐漸轉為淡黃色，經過暗處理的葉片在培養18 d時出現了綠色芽點，沒有暗處理的葉片則在培養22 d時才有綠色芽點出現。

在培養28 d后，不同培養方式對葉片愈傷及褐化的影響表現得更明顯（表2）。

表2 不同培養方式對辣椒棗葉片再生的影響

從表2可以看出，2種培養方式相比較，無論是正放還是反放，經過暗處理的辣椒棗葉片出愈率均較高，褐化率均較低。從最終的不定芽再生數來看，有暗處理的葉片較沒有暗處理的葉片高71%（正放）和78%（反放）。盡管統計分析顯示，各處理結果間差異未達到0.05顯著水平，但暗處理有利于辣椒棗葉片再生這一點是可以肯定的。

2.2 不同接種方式對葉片再生的影響

表3是暗培養條件下葉片不同接種方式的處理結果。從表3可以看出，辣椒棗葉片正放比反放出愈率高，但差異未達到顯著水平。褐化率正放也比反放高，分別為62%和40%。這可能與葉片結構有關。葉片結構具有背面葉肉細胞排列較正面疏松、氣孔數量較正面多的特點。因此，葉背面與培養基接觸則容易吸收養分，出愈率較高；但所吸收的養分中有些物質又是極易導致褐化的。因此，褐化率正放比反放高，最終導致正放的不定芽再生數低于反放，分別為1.20，1.42個。

另外，在培養過程中觀察發現，辣椒棗的愈傷組織先從葉片背面的葉脈長出，葉片反放有利于愈傷組織及芽點的觀察。故本試驗認為，辣椒棗葉片再生培養時，以葉片反放（即葉片背面朝上）為最好。

表3 不同接種方式對辣椒棗葉片再生的影響

2.3 不同培養基對葉片再生的影響

2.3.1直觀分析采用L9（34）正交表進行4因素3水平的正交試驗，旨在找出辣椒棗葉片再生的最佳培養基。從表4可直觀地看出，第1個組合的不定芽再生數最高，均值達每葉片5.400 2個。最優培養基組合為A1B1C1D1。

周瑞金[8]研究得出，葉片在以MS為基本培養基時，形成愈傷組織較多，不定芽80%是從葉片正面產生；在以WPM為基本培養基時，愈傷組織少，葉片褐化重，但不定芽再生數量多，且不定芽多從葉片背面不經過愈傷組織而直接生成，質量較高。本試驗也有相似現象。從表4可以看出，在7，8，9號組合中，葉片大多褐化，出愈率為0，但在7號組合中，葉片最終平均每個葉片長出0.133 2個再生芽。但總的來看，第7，8，9號組合不定芽再生數大多為0，這表明WPM不適合作為辣椒棗葉片再生的基本培養基。

2.3.2 極差分析 表5是不同因素對辣椒棗不定芽再生數影響的極差大小分析。

表4 正交試驗結果

由表5可知，調整后的R值排序為RA＞RB＞RD＞RC，則影響不定芽再生數的因素主次順序為A＞B＞D＞C。根據各因素水平均值的大小，可得不定芽再生數最高的培養基組合為A1B1D1C1。

表5 極差分析結果

2.3.3 方差分析 表6表明，基本培養基對不定芽再生數的影響最大，達到極顯著水平（P＜0.01），TDZ和糖濃度對不定芽再生數也影響顯著（P＜0.05），而IBA對再生數的影響不顯著。由F值的大小得出，影響不定芽再生數的主要因素A＞D＞B＞C。表5中B和D的極差值相差只有0.000 1，綜合極差分析和方差分析，在本試驗中4個因素對不定芽再生數的影響大小為A＞D＞B＞C。

表6 方差分析結果

2.3.4 多重比較 表7是不同處理因子各水平間的多重比較，結果表明，A因素各水平中，A1相對于A2，A3對辣椒棗葉片不定芽再生數有明顯提高，方差分析達極顯著水平（P＜0.01），這說明1/2 MS（大）培養基相對于MS培養基和WPM培養基更有利于辣椒棗葉片再生。B，C，D因素各水平中以B1，C1，D1對不定芽再生更有利，但它們在0.01水平上差異均未達顯著水平。

表7 不同處理因子各水平間差異顯著性檢驗

綜合直觀分析、極差分析、方差分析和多重比較的結果，確定辣椒棗組培苗葉片再生的最優培養基為A1D1B1C1，即1/2 MS（大）＋TDZ 0.3 mg/L＋IBA0.1 mg/L＋糖 20 g/L。

3 結論與討論

辣椒棗葉片再生培養中，適當的暗處理有利于辣椒棗葉片愈傷組織的形成，并能促進愈傷組織盡快形成芽點，有利于縮短葉片再生培養時間。本試驗中暗處理時間為14 d，在今后的研究中還有待進一步確定暗處理的最佳時間。

在有關棗的葉片再生研究中，何業華等[9]對來自日本山形縣和富山縣的普通棗研究發現，暗處理時葉片愈傷率達100%，光照條件下愈傷率僅為10%，葉塊枯死率達78%，愈傷組織的質量減少，顏色加深；暗培養條件能促使葉塊產生較多的不定根，而在光照條件下，未見不定根的發生。這說明光對日本山形縣和富山縣的普通棗外植體愈傷組織的形成有阻礙作用，暗處理可以促進愈傷組織的發生。其他研究也發現，暗培養較光照培養有利于民勤小棗愈傷組織的誘導[3]，對防止褐化和促進木棗葉片再生也有顯著的效果[10]。

而梁國棟等[11]在誘導駿棗葉片愈傷組織過程中發現，最適于誘導的條件應該是前期光培養后期暗培養；李云等[12]在溫度（25±2）℃、光照時間12 h/d、光照強度2 000 lx的條件下，將贊皇大棗葉片培養30 d后，由葉背處誘導出了不定根。2種相反的結果說明，不同基因型的物種在葉片再生時對光的需求不同。因此，必須根據研究試材分別進行探索，才能確定其最佳的葉片培養方式。除了對光的需求不同外，不同基因型物種在葉片再生培養時所需的放置方式也不一樣。王慧瑜等[7]發現，雞心棗試管苗葉片以葉背面接觸培養基最易誘導出不定芽；而陳宗禮等[5]則發現，沾化冬棗葉片背面向上的愈傷組織誘導率比向下的約高出36%左右。在本試驗中，葉片正放出愈率高，同時褐化率也高；葉片反放便于愈傷組織及芽點的觀察，褐化率低，最終的不定芽再生數高于葉片正放，是辣椒棗葉片再生培養中的最佳放置方式。

本試驗正交試驗結果表明，基本培養基，TDZ，IBA和糖4個因子對辣椒棗葉片再生影響大小排序為：基本培養基＞糖＞TDZ＞IBA。1/2 MS（大）為最優培養基，WPM不適合作為辣椒棗的葉片再生培養基。經直觀分析、極差分析、方差分析和多重比較，可以確定辣椒棗組培苗葉片再生的最優培養基為1/2 MS（大）＋TDZ 0.3 mg/L＋IBA0.1 mg/L＋糖20 g/L，其平均每葉片再生不定芽能達到5.4個。

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