微量元素鈷對脆桿藻和斜生柵藻增殖的影響

張瑋瑋，王家官

（1.山西生物應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)廳農(nóng)墾局，山西太原 030031）

鈷（Co）屬鐵族元素，為順磁性銀白色金屬。半個世紀以來，鈷的研究取得了很大進展，迄今為止，已證實鈷元素是人體、動物、藻類、微生物及豆科作物等所必需的微量營養(yǎng)元素[1-2]，是植物生長的有益元素，對多種農(nóng)作物有增產(chǎn)作用[3]。大量研究表明，鈷及其化合物具有一定的生物學(xué)效應(yīng)和藥理作用。在高等植物中，鈷可以提高葉片葉綠素含量，增強植株的光合作用，對多種作物有增產(chǎn)作用。鈷參與機體酶的組成以及對酶具有活化作用，可治療多種貧血；鈷鹽對低色素小細胞性貧血的療效較好；鈷參與構(gòu)造維生素B12的特定結(jié)構(gòu)，對高色素巨細胞性貧血療效顯著，因而，鈷的研究引起了人們的重視[4-5]。目前，在藻類中也開展了一些工作，崔青曼等[6]試驗表明，低濃度的鈷對小球藻、極大螺旋藻的生長具有明顯的促進作用。重金屬對藻類生物的影響主要體現(xiàn)在2個方面：一方面是重金屬對藻類的致毒效應(yīng)，另一方面是重金屬可提高藻類的新陳代謝過程，促進生長[7]。比較重要的微量金屬有Fe，Mn，Cu，Mg，Mo，Co等，其主要機理是作為輔助因子參與生物生化反應(yīng)，以促進生物增殖。在對汾河水庫水體監(jiān)測的過程中發(fā)現(xiàn)，鈷濃度的變化與硅藻、綠藻的消長有一定的相關(guān)性。

本試驗采用藻類增長潛力試驗（AGP）探討了鈷對脆桿藻（硅藻）和斜生柵藻（綠藻）細胞增殖的影響，以期從微量元素角度探討汾河水庫浮游藻類細胞密度上升較快的原因,為防治水體富營養(yǎng)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的藻種是脆桿藻（Fragilariasp.Fachb-218）和斜生柵藻（Scenedesmus obiquus）。

1.2 試驗方法

1.2.1 藻種的馴化與培養(yǎng) 將藻種在MGC－300B型微電腦控制光照培養(yǎng)箱中進行無菌馴化培養(yǎng)。斜生柵藻選用BG11培養(yǎng)基，脆桿藻選用D1培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為：光照強度2 000 lx，光暗比14 h∶10 h。經(jīng)過14～21 d的馴化培養(yǎng)，藻種可達到試驗要求。

1.2.2 Co2+質(zhì)量濃度梯度的培養(yǎng)基配制 用Co（NO3）2·6H2O配置系列 Co2+質(zhì)量濃度梯度的培養(yǎng)基，如表1所示。

表1 培養(yǎng)基中Co2＋的質(zhì)量濃度梯度

1.2.3 接種 用722S分光光度計測出斜生柵藻與脆桿藻藻種液的細胞光密度值為0.1～0.2時，進行接種。取50 mL藻種液，在3 500 r/min下離心10 min，棄上清液。沉淀的藻細胞用0.001 5%碳酸氫鈉水溶液重新懸浮，再離心，以除去營養(yǎng)物及其他物質(zhì)。這樣的洗滌過程進行2次，最后用碳酸氫鈉水溶液再懸?。ㄌ妓釟溻c液的體積根據(jù)已計算出的用于接種時所需要的藻種液的細胞密度來確定）。接種完畢，錐形瓶用透氣膜封蓋，在設(shè)定條件下進行培養(yǎng)。

1.2.4 試驗條件 斜生柵藻培養(yǎng)溫度（25±1）℃，脆桿藻培養(yǎng)溫度（22±1）℃，光照強度為2 000 lx，光暗比14 h∶1 0 h。為減少因光照不均勻可能造成的影響，每隔2～3 h搖動并更換各試驗組錐形瓶的位置1次。保持試驗液pH值≤8.5。

1.2.5 光密度（OD）值與葉綠素 a（Chla）的測定

培養(yǎng)液中藻細胞密度能決定其光密度（OD）的大小和葉綠素a（Chla）含量的高低。本試驗通過測定試驗液中OD和Chla的數(shù)值來說明2種藻的細胞密度消長狀況。

OD值的測定：先用紫外分光光度計測定斜生柵藻和脆桿藻的全吸收波譜，確定它們的吸收峰，然后將試驗液在722S可見分光光度計上測定OD值。斜生柵藻和脆桿藻測定750 nm（吸收峰）處的OD值。從試驗第2天開始，每隔1 d測定1次，直到試驗結(jié)束，每次測定的時間基本相同。

葉綠素a的測定：采用甲醇萃取法。取3 mL試驗藻液在3 500 r/min下離心10 min，棄去上清液，然后等體積加入90%（V/V）無水甲醇，混勻，放置在4℃黑暗條件下萃取6～8 h，離心，取上清液，在722S可見分光光度計上測定665 nm處光密度值。根據(jù)公式C（μg/mL）＝OD665×13.9，計算出葉綠素a的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈷對脆桿藻增殖的影響

2.1.1 不同質(zhì)量濃度（A～E）Co2+對脆桿藻OD值的影響 試驗結(jié)果（圖1）顯示，在試驗的前4 d，脆桿藻處于增殖的調(diào)整期，從第7天開始，A，B，C，D組的該藻細胞均不同程度進入分裂增殖對數(shù)期，B，C組增長幅度較大，并一直呈上升趨勢，而D，E組雖也增長但趨勢比較緩慢，直到第8天后，開始有緩慢增殖。試驗結(jié)果還顯示，當Co2+質(zhì)量濃度在0.120 0～0.167 8 μg/L之間時，脆桿藻增殖比較明顯；當Co2+質(zhì)量濃度達到0.284 9 μg/L時，該藻的增殖受到很大抑制，至第12天細胞分裂基本停止。

由B組與D組細胞吸光值的t檢驗結(jié)果得出，B組與D組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。此檢驗說明，在氮磷營養(yǎng)鹽等條件適宜的情況下，低質(zhì)量濃度的鈷對脆桿藻藻細胞的增殖有明顯的促進作用。

2.1.2 不同質(zhì)量濃度（A～E）Co2+對脆桿藻葉綠素a含量的影響 葉綠素a的含量能反映出不同鈷質(zhì)量濃度下脆桿藻細胞的增殖狀況。從圖2可以看出，Co2+質(zhì)量濃度為0.120 0 μg/L時（B組），葉綠素a含量增長較快；Co2+質(zhì)量濃度在0.229 1～0.284 9 μg/L之間時，葉綠素a含量增長受到抑制。

從圖2可以看出，脆桿藻葉綠素含量的變化與OD值變化趨勢基本一致，呈正相關(guān)。圖1顯示，A組在接種7 d后細胞分裂進入對數(shù)期，但增長幅度較小，到第10天達到最大值，以后呈下降趨勢。其變化趨勢與B組、C組類似。圖2顯示，A組與B組、C組的變化趨勢基本一致。A組的這種變化趨勢的原因可能是脆桿藻對鈷元素的需要極其微量，在接種之前藻細胞中已含有的鈷元素維持了它前期細胞增殖的需要，隨著鈷元素消耗，細胞密度明顯下降（圖1）。

2.2 鈷對斜生柵藻增殖的影響

2.2.1 不同質(zhì)量濃度（A～G）Co2+對斜生柵藻光密度值的影響 試驗結(jié)果（圖3）顯示，在試驗的前4 d，斜生柵藻處于增殖的調(diào)整期，從第5天開始，各試驗組的該藻細胞均不同程度進入分裂增殖對數(shù)期，B，C，D組增長幅度較大，并一直呈上升趨勢，而E，F(xiàn)，G組增長趨勢比較緩慢，尤其G組到12 d后細胞分裂基本停止。試驗結(jié)果還顯示，當Co2+質(zhì)量濃度在0.120 0～0.229 1 μg/L之間時，斜生柵藻的增殖比較明顯；當Co2+質(zhì)量濃度達到0.328 1 μg/L時，該藻的增殖受到抑制，接種后至第10天細胞分裂緩慢。當Co2+質(zhì)量濃度達到0.328 1 μg/L以上時，該藻生長繁殖基本停止。

C組與E組細胞吸光值的t檢驗結(jié)果顯示，C組與E組之間有顯著性差異（P＜0.05）。C組鈷的質(zhì)量濃度為0.167 8 μg/L，E組鈷的質(zhì)量濃度為0.284 9 μg/L。此檢驗說明，在氮磷營養(yǎng)鹽等條件適宜的情況下，低質(zhì)量濃度的鈷對斜生柵藻藻細胞的增值有明顯的促進作用。

2.2.2 不同質(zhì)量濃度（A～G）Co2+對斜生柵藻葉綠素a含量的影響 葉綠素a的含量能反映出不同鈷質(zhì)量濃度下斜生柵藻細胞的增殖狀況。結(jié)果顯示，Co2+質(zhì)量濃度為 0.167 8 μg/L時（C組），葉綠素a含量增長較快；Co2+質(zhì)量濃度在0.284 9～0.350 0 μg/L之間時，葉綠素a含量增長受到抑制。

從圖3，圖4可以看出，A組與B組、C組的變化趨勢基本一致。由此可以得出，斜生柵藻與脆桿藻一樣，對于鈷元素含量的要求都非常低。

2.3 汾河水庫中鈷的含量及其與浮游藻類密度的關(guān)系

汾河水庫位于山西省太原市西北婁煩縣境內(nèi)，下靜游村至下石家莊之間引黃入晉工程實施后，汾河水庫作為黃河水的調(diào)蓄水庫，擔(dān)負起省城340萬人的飲水供應(yīng)任務(wù)，成為省城最主要的水源地。自1961年建成后，其水質(zhì)良好，一直保持在國家地表水環(huán)境質(zhì)量Ⅱ類水標準（GB 3838—88）。但是1999年以來，由于我國華北地區(qū)連續(xù)干旱和上游用水量增加等原因，使庫區(qū)蓄水量急劇減少，環(huán)境容量迅速萎縮，加之面源、點源和內(nèi)源的污染，使庫區(qū)水體中浮游藻類的密度上升較快。初步調(diào)查顯示，除了上述原因造成庫區(qū)水體中以N，P為主的營養(yǎng)鹽含量增長以外，微量元素也起著一定作用。

2010年4月、9月與2011年5月、9月對汾河水庫8個斷面的微量元素進行檢測，鈷的含量在不同的時間段變化趨勢不同，其結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，2010年4月和2011年5月這2個月份中Co2+的含量比較高；而2010年9月和2011年9月Co2+的含量卻相對較低。汾河水庫浮游藻類密度隨著季節(jié)的變化而改變，在相應(yīng)的時間內(nèi)硅藻、綠藻和藍藻的密度變化如圖6所示。

在庫區(qū)水體物理、化學(xué)指標一定的前提下，從圖5，6可以看出，水體中鈷的質(zhì)量濃度同浮游藻類中硅藻、綠藻的生長有一定的相關(guān)性，即當鈷的含量較高時，硅藻、綠藻的細胞密度相應(yīng)較少，同時由于4，5月光照弱、水溫低，不利于藻類的生長，所以，藻細胞密度較少；反之，當鈷的含量較低時，硅藻、綠藻的細胞密度會相應(yīng)增加，同時由于9月光照強、水溫高，有利于藻類的生長，所以，藻細胞密度較多。而對于藍藻來說，鈷的含量多少對其生長影響沒有規(guī)律性。這一結(jié)論與AGP試驗結(jié)果剛好吻合。這表明，低質(zhì)量濃度的鈷常具有促進藻類生長的作用，而高質(zhì)量濃度的鈷則有抑制作用，嚴重時會產(chǎn)生毒害作用。

3 結(jié)論與討論

鈷是藻類許多生理過程中起重要作用的微量元素，在適當?shù)臐舛认驴纱龠M許多酶的活性。草酰乙酸脫羧酶是一種催化CO2分子從草酰乙酸上脫落下來的酶，Co2+的質(zhì)量濃度對該酶的活性有很大的影響，低質(zhì)量濃度時，酶的活性較高，而高質(zhì)量濃度時酶的活性會受到很大程度的抑制。鈷離子能使核酸解聚，結(jié)合在磷酸酯基上的金屬離子可從RNA和多核酸的磷酸二酯鏈上奪取電子，從而使得成鍵不穩(wěn)定和易水解，這樣生物大分子可降解成小碎片，從而使生物機體發(fā)生病變[7-8]。錳、鎳等也可促使這種降解作用。一般情況下，重金屬對藻類的致毒效應(yīng)主要表現(xiàn)在：影響藻類的生長代謝、抑制光合作用、減少細胞色素，導(dǎo)致細胞畸變[9-10]。

無論是在人工培養(yǎng)液還是天然水體中，重金屬的種類與數(shù)量都不可能是單一的、固定不變的，各種水生生物，包括藻類，常受到多種重金屬聯(lián)合作用的綜合影響。重金屬彼此間的相互作用有拮抗、協(xié)同、相加和致敏4種，已查明，許多成對的元素在生物學(xué)上表現(xiàn)出拮抗效應(yīng)[11]，常見的有：Hg－Cu，Cd－Zn，F(xiàn)e－Mn，Cu－Co等；有時是2種以上的元素起作用，如：Co－Cu－Mn。在高等植物中，鈷可以提高番茄葉片葉綠素含量、增強植株的光合作用，并顯著提高番茄的坐果率、單株結(jié)果數(shù)和產(chǎn)量。

本試驗的結(jié)果顯示，脆桿藻和斜生柵藻在不同的鈷質(zhì)量濃度下增長的情況不同，在質(zhì)量濃度較低時，影響藻類的生長代謝；在適宜的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，能增強藻類的光合作用，使藻細胞數(shù)量增殖較快；質(zhì)量濃度較高時，藻細胞數(shù)目增殖較慢，原因可能是藻類生長除了受鈷的影響外，還受到其他一些因素的影響，如金屬間的相互作用等。

［1］陳仕光，孫洪偉，王志紅.典型微量營養(yǎng)元素P，F(xiàn)e，Mn，Zn對藍藻藻華影響研究 [J].廣東工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011（2）：10-15.

［2］樊文華，李莉.硒鈷配施對番茄產(chǎn)量、番茄紅素及硒、鈷含量的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（10）：19-22.

［3］陳仕光，王志紅，曹欣.典型性微量金屬元素對藻華的激勵趨勢探討 [J].華南師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010（2）：85-92.

［4］邱保勝，劉樹文，戴國政.藻類利用微量金屬元素的研究技術(shù)與方法[J].水生生物學(xué)報，2009，33（2）：330-337.

［5］劉素萍，樊文華.鈷對番茄生長發(fā)育影響的初步研究[J].土壤通報，2005，36（6）：425-428.

［6］崔青曼，幺宗利，袁春英.極大螺旋藻培養(yǎng)液中5種微量元素最佳濃度的研究[J].齊魯漁業(yè)，2002，19（9）：1-3.

［7］鄧衛(wèi)東，毛華明.微量元素鋅和鈷的生物學(xué)功能和營養(yǎng)狀況的評價[J].云南畜牧獸醫(yī)，1999（2）：20-22.

［8］李洪益.重要的微量元素鈷 [J].微量元素與健康研究，2004，21（1）：61-62.

［9］郁建栓.淺談重金屬對生物毒性效應(yīng)的分子機理[J].環(huán)境污染與防治，1996，18（4）：28-31.

［10］況琪軍，夏宜，惠陽.重金屬對藻類的致毒效應(yīng)[J].水生生物學(xué)報，1996，20（3）：277-283.

［11］李建國，王金莉.微量元素之間的協(xié)同與頡頏 [J].飼料博覽，2004（7）：28-30.