六類新藥凈固片提取物的主要活性成分研究

嚴啟新，高 媛，李 勇，李 姿

凈固片為深圳海王藥業公司開發的六類抗痔瘡新藥，處方源于金代四大名醫之首的張從正《儒門事親》中的凈固方[1]，以槐花(炒)為主要成分，可治療“痔漏、下血癢痛”等癥。藥理學研究表明，其具有顯著的抗炎、鎮痛、止血、止癢、抗微血管滲透、抗肛門腫脹、促潰瘍愈合和體外抑菌等作用，但療效的主要成分尚不清楚。為此，筆者采用高效液相色譜法(HPLC)及高效液相色譜－液質聯用(HPLC－MS)方法，首次研究了凈固片的主要活性成分，現報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀，包括低壓四元梯度泵、二極管陣列檢測器、自動進樣器、在線脫氣機。凈固片原料(提取物)，本公司自制，樣品A批號為20080324，樣品B批號為20080415;異鼠李素對照品(批號為110860－200406)，橙皮苷對照品(批號為110721－200512)，柚皮苷對照品(批號為110722－200610)，蘆丁對照品(批號為100080－200707)，槲皮素對照品(批號為100081－200406)，均中國藥品生物制品檢定所提供;新橙皮苷對照品(Sigma公司，批號為048K1146);乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

分別稱取樣品A和B約50 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加適量甲醇，超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液A和B。稱取異鼠李素對照品5.05 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中;稱取橙皮苷對照品5.73 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中;稱取新橙皮苷對照品6.18 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中;稱取蘆丁對照品11.07 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中;稱取柚皮苷對照品10.08 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加適量甲醇，超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中;稱取槲皮素對照品7.18 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中。分別加適量甲醇于上述量瓶中，超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得各對照品溶液。

2.2 高效液相色譜法定性研究

2.2.1 定性檢測

色譜條件:色譜柱為依利特公司Kromasil C18柱(250 mm×4.6mm，5μm)，檢測波長為 283nm，柱溫 30℃，流動相為 0.05mol/L乙酸銨水溶液(冰醋酸調pH至3.8)－乙腈，梯度洗脫。流動相洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫表(條件一)

測定方法:取供試品溶液及對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀。結果見表2。可見樣品中均含有蘆丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、槲皮素等;在該色譜條件下，無法顯示異鼠李素對照品。

表2 兩種色譜條件下顯示的各峰保留時間(min)及成分確認

2.2.2 色譜條件改進

為防止單一色譜條件的偶然性，現改善色譜條件并進行綜合比較，觀察色譜峰的特征。將2.2.1項下色譜條件中流動相梯度洗脫程序進行改進，見表3。取供試品溶液及對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀。結果見表2。可見，樣品中均含有蘆丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、槲皮素等;異鼠李素在該色譜條件中出現，但綜合看，為其他雜峰。

2.3 高效液相色譜－液質聯用鑒定研究

2.3.1 檢測條件

液相色譜條件:Agilent 1100型高效液相色譜儀。色譜柱為依利特公司 Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm)，檢測波長283 nm，流動相為0.05 mol/L乙酸銨水溶液(冰醋酸調 pH至3.8)－乙腈，梯度洗脫，分離條件仍按2.2.1項下條件一。

表3 流動相梯度洗脫程序改進表(條件二)

質譜條件:Bruker Esquire 2000型質譜儀。ESI源，正離子檢測;鞘氣(N2)流速30 psi，輔助氣(N2)流速10 L/min;碰撞氣體為氦氣;毛細管溫度300℃，毛細管電壓－116.7 V;采用全離子掃描方式，掃描范圍為50～2 200 m/z。

2.3.2 成分鑒定

從色譜分離圖中依次可見5個最主要的色譜峰。在相對保留時間(RT)為 25.873時，為蘆丁，分子式和相對分子質量為C27H30O16(610);ESI中，m/z 609.1 為[M －H]+。在 RT 為 41.20時，結合文獻[1－2]，可推斷可能為異柚皮苷，其分子式和相對分子質量為 C27H32O14(580);ESI中，m/z579.1為[M－H]+。在 RT為48.021時，結合文獻[3]，可推斷為柚皮苷，其分子式和相對分子質量為 C27H32O14(580)，ESI中，m/z579.1 為[M －H]+。在 RT為53.642時，結合文獻，可推斷為橙皮苷，其分子式和相對分子質量為 C28H34O15(610);ESI中，m/z579.1為[M －H]+。在 RT 為59.165時，結合文獻，可推斷可能為新橙皮苷，其分子式和相對分子質量為 C28H34O15(610);ESI中，m/z 609.1為[M－H]+;在RT為77.194時，結合文獻，推斷可能為槲皮素其分子式和相對分子質量為 C15H12O7(302);ESI中，m/z300.9為[M －H]+，但結合前期對照品的研究，可確定。

3 討論

本研究結果顯示，凈固片的主要成分為蘆丁(rutin)、柚皮苷(naringin)、橙皮苷(hesperidin)、新橙皮苷(neohesperidin)、槲皮素(quercetin)。治療痔瘡的進口藥痔根斷和愛脈朗的主要成分為蘆丁和柚皮苷，與凈固片的主要成分類似。

凈固片與兩種進口制劑的主要成分類似，說明傳統古方的藥效學物質基礎和現代新藥成分具有相似性，也表明了凈固片組方的合理性。凈固片的主要藥理學研究結果也驗證了其對痔瘡的治療效果。

[1]張從正.儒門事親(卷十五:腸風下血)[M].上海:上海科學技術出版社，1990:448.

[2]賈 強，白 楊.枳殼和枳實化學成分的HPLC－ESI－MS鑒定[J].中草藥，2005，36(2):169 －172.

[3]周大勇，徐 青，薛高興.高效液相色譜－電噴霧質譜法測定枳殼中黃酮苷類化合物[J].分析化學，2006，34(9):31 －35.