新生大鼠海馬神經元原代培養及膜片鉗全細胞記錄＊

徐祖才，徐 平，張 駿，雷顯澤，徐忠祥，王學峰

（1.重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科 400016；2.遵義醫學院附屬醫院神經內科，貴州遵義563003）

原代培養的神經元已經成為神經學科領域的同行們最常用的實驗對象之一，因此，神經元的原代培養方法日漸增多。隨著神經電生理實驗技術的迅速發展，特別是膜片鉗技術在神經學科的應用以來，對原代培養的神經元狀態要求越來越高，本實驗在參照文獻［1－4］的培養方法基礎上稍作改進，培養出細胞膜上各離子通道功能良好的且適應于膜片鉗全細胞記錄的海馬神經元，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物與主要實驗儀器 1d內新生Wistar大鼠購自重慶醫科大學實驗動物中心；SW－CJ－2FD型超凈工作臺購自蘇凈集團安泰公司，細胞培養箱購自美國Thenno Fonna，細胞培養板購自美國Costar，TE2000－U倒置相差顯微鏡購自日本Nikon；TDZ5－WS多管架自動平衡離心機購于長沙湘儀離心機儀器有限公司，TCS－SP2型激光共聚焦掃描顯微鏡購自德國Leica，NVSLM1型振動切片機購自英國Campden，電極拉制儀（P－97）購自美國，玻璃微電極管（外徑1.0mm）購自南京六合泉實驗器材廠，膜片鉗系統購自美國Axon。

1.1.2主要試劑 神經基礎培養基（Neurobasal media）、B－27、L－谷胺酰胺及特級胎牛血清購自美國Gibco公司。種植液組成：神經基礎培養基、2%B－27（體積比）、0.5μmmol/L L－谷胺酰胺及10%胎牛血清；維持液：神經基礎培養基、2%B－27（體積比）和0.5μmmol/L L－谷胺酰胺。D－Hanks和多聚－L－賴氨酸購于美國Sigma公司，胰蛋白酶由上海佰奧生物科技有限公司提供，小鼠抗NeuN一抗購自美國 Millipore、兔抗小鼠FITC二抗由北京中杉公司分裝，重慶醫科大學附屬第一醫院提供10%水合氯醛。人工腦脊液（Artificial cerebrospinal fluid，ACSF）配方及各成分濃度：NaCL 124mmol/L，KCL 3 mmol/L，CaCL22mmol/L，MgCL22mmol/L，NaH2PO41.23 mmol/L，NaHCO326mmol/L和葡萄糖10mmol/L；電流鉗模式下記錄動作電位的電極內液配方及各成分濃度：K2SO460 mmol/L，N－甲基－D－葡糖胺（NMG）60mmol/L，4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）40mmol/L，MgCl24mmol/L，四乙酸（BAPTA）0.5mmol/L，磷酸肌酸（phosphocreatine）12mmol/L，Na2ATP 2mmol/L 和 Na3GTP 0.2mmol/L；電壓鉗模式下記錄電流的極內液成分和相應濃度：KCL 140mmol/L，MgCL20.5 mmol/L，乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）2mmol/L，HEPES 5 mmol/L，K2ATP 4mmol/L，KOH將pH值調至7.2。

1.2方法

1.2.1海馬神經元原代培養 先在蓋玻片上涂抹0.1%多聚－L－賴氨酸，在超凈臺內，經紫外燈照射消毒后，放置在24孔細胞培養板孔內備用。選擇1d內的新生Wistar大鼠，迅速剝出全腦，移入0℃D－Hanks液中，分離雙側海馬并剪碎。加入0.125%胰蛋白酶（體積相當于腦組織的5倍）并置于5%CO2、37℃細胞培養箱內消化20～30min，后加入相同體積的種植液并維持5min以終止消化。1 000r/min離心5min，棄上清液，加入種植液，使用拋光冷卻后的巴氏管輕柔吹打，制成細胞懸液，使用200目篩網過濾，經計數后，以種植液稀釋成5×105/mL的細胞懸液，24孔細胞培養板的每孔按1mL懸液進行接種，置入5%CO2、37℃細胞培養箱內培養1d即全液更換維持液培養，后每間隔3d更換一半培養液。

1.2.2免疫熒光技術鑒定神經元 神經元核抗原（Neuronal nuclei，NeuN）是神經元細胞核中的一種特異性蛋白質，被認為是成熟神經元的特異性標記物［5］。神經元培養至第10天時，進行細胞爬片，放置載玻片上，經4%多聚甲醛固定30min后，PBS清洗5min×3次，10%山羊血清封閉液常溫下處理30min，后傾去血清，加入小鼠抗NeuN抗體（稀釋比例1∶100），置4℃冰箱過夜。次日，取出后常溫放置2h，PBS清洗5 min×3次，避光加山羊抗小鼠FITC（稀釋比例1∶50），常溫2 h后，PBS清洗5min×3次，50%甘油封片備用，擇期在激光共聚焦掃描顯微鏡下拍照。

1.2.3膜片鉗全細胞記錄 參照文獻［6］的方法，將備用的細胞爬片轉移入浴槽中，使用輸液泵持續向浴槽灌注95%O2＋5%CO2混合氣飽和的ACSF，浴槽流出端使用蠕動泵將液體以3～4mL/min恒速泵出，調整輸液泵至細胞在液面下1～2 mm為適。P－97微電極拉制儀拉制記錄微電極（直徑1～2 μm），電極內液使用0.2μm的微孔濾膜濾過后充灌電極，充灌電極內液后入水電阻2～4MΩ。選擇表面光滑且透光度好的狀態良好的神經元進行實驗，封接成功后，抽吸破膜即可形成全細胞記錄。在電流鉗模式下，記錄自發性動作電位（action potential，AP）；在電壓鉗模式下記錄自發性興奮性突觸后電流（spontaneous excitatory postsynaptic current，sEPSC），信號采集分析均由pClamp 9.2軟件完成。

2 結 果

2.1海馬神經元形態學觀察 神經元在1d后更換全液，此時在倒置相差顯微鏡下觀察，神經元貼壁穩定，且背景較干凈，部分神經元可見較短突起長出（封2圖1A）；3d后，神經元突起明顯變長變多，且細胞體輪廓清晰，呈錐形（封2圖1B）；至第10天時，神經元形態特征明顯，細胞體表面光滑，透光度好，可見細胞周圍明顯光暈，突起增多增長且細出現分支，從而形成明顯的神經網絡（封2圖1C、D）。

圖3 膜片鉗全細胞記錄

2.2NeuN鑒定海馬神經元 NeuN免疫熒光染色，激光共聚焦掃描顯微鏡下可見神經元細胞核著綠色，細胞質和突起不著色，最終發現本方法所培養的神經元純度可達100%，見封2圖2。

2.3膜片鉗全細胞記錄 在電流鉗模式下，可記錄到神經元的偶爾自發性AP，膜電位在－65.2mV左右（圖3A）；在電壓鉗模式下，可以記錄到神經元的sEPSC（圖3B）。

3 討 論

海馬是整個中樞神經系統對缺血、缺氧、炎癥等各種損傷耐受能力最差的部位之一，且所含神經元密度高，非神經元細胞相對較少，因此，海馬常常被作為神經元原代培養的首選部位。作者闡述了1d內鼠齡的Wistar大鼠海馬神經元的原代培養方法，在培養1d后細胞基本貼壁；3d開始細胞體逐漸豐滿，突起開始變長；到達第10天時，神經元已經成熟，細胞體形態特征明顯，立體感強，表面光滑，透光度良好，周圍光暈明顯，突起豐富且細胞與細胞之間形成明顯的神經網絡結構。通過神經元特異性核抗原NeuN及FITC標記，發現所培養的神經元純度高。為了檢測神經元的電生理特征是否完好，通過膜片鉗全細胞記錄，發現細胞封接順利，在電流鉗模式下可以記錄到偶爾自發性AP，在電壓鉗模式下可以記錄到sEPSC，從而證實了細胞膜以及突觸傳遞功能良好，適合膜片鉗技術的應用。

針對神經元原代培養的實驗對象選擇上，目前除了本實驗選擇的新生鼠外，還可以選用胎鼠，但由于胎鼠的胎齡不易掌控，并且胎鼠的海馬剝離困難且體積偏小，而使得該方法的推廣遇到了瓶頸［7］。在培養方法上，有選擇普通培養基，外加抑制細胞有絲分裂的藥物阿糖胞苷，然而，該藥物的使用量較難控制，過量時，在抑制膠質細胞的繁殖和生長的同時，對神經元的正常生長也有一定的毒副作用，從而影響其活性，達不到實驗需求，量不夠時，則不能很好地抑制膠質細胞的增殖［8］。本實驗直接選用神經基礎培養基及B－27添加劑，能夠抑制非神經元的生長而更有利于神經元的生長，從而可以提高神經元的純度，此外，該組合的培養基中含有多種抗氧化劑，具有保護神經元的作用，從而保證神經元的最終活性［9］。

隨著神經學科的快速發展，海馬神經元及膜片鉗技術有機結合在神經生理功能及病理狀態的應用方興未艾，如興奮性氨基酸神經毒性［10］、缺氧性損傷［11］、癲癇［12－14］和單純皰疹病毒性腦炎［15］等。本實驗所提供的海馬神經元原代培養方法，可為膜片鉗技術的順利應用打下良好的基礎。

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