TSH受體介導(dǎo)高分子納米藥物對(duì)甲狀腺癌的靶向性研究＊

范永增，袁耿彪△，朱曉娥，包建東，李 春

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 400010；2.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇無(wú)錫214063；3.美國(guó)德州安德森癌癥中心，美國(guó)77030）

甲狀腺癌是一組異質(zhì)性腫瘤，其在生物學(xué)行為，組織學(xué)表現(xiàn)及對(duì)治療的反應(yīng)等方面都有明顯差異。近年來(lái)，甲狀腺癌發(fā)病率不斷升高，其中90%為分化型甲狀腺癌（Differentiated thyroid carcinoma，DTC）［1］。在疾病的進(jìn)展過(guò)程中，有20%～40%的DTC患者會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其中30%的DTC患者會(huì)發(fā)生退行性病變、腫瘤侵襲性增強(qiáng)、伴有遠(yuǎn)處播散、攝碘能力減低；其中部分DTC患者經(jīng)放射性碘（Radioiodine－131，131I）清除或多次131I治療時(shí)，對(duì)131I反應(yīng)性降低、不敏感或耐受等。多種因素造成復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移病灶攝碘能力下降，131I不能完全清除復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移DTC病灶、導(dǎo)致了131I全身診斷顯像（131I－whole body scan，131I－WBS）對(duì)DTC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移病灶的診斷率不高，限制了131I治療，降低了131I體內(nèi)照射治療的效果，降低了帶瘤患者的生存率和生活質(zhì)量，給DTC術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移癌的診斷和治療造成困難，嚴(yán)重威脅患者的身體健康。本實(shí)驗(yàn)旨在制備一種促甲狀腺素（TSH）受體介導(dǎo)的靶向高分子納米藥物，為進(jìn)一步體內(nèi)及臨床靶向納米藥物的研究打下前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 羧基端乳酸/羥基乙酸共聚物（PLGA－COOH，聚合比例為50∶50）；重組人促甲狀腺素（rhTSH）（Abcam Corp，英國(guó)）；鼠抗人 TSH 單克隆抗體（Abcam Corp，英國(guó)）；MES緩沖液（配制濃度0.1mol/L，NaOH 調(diào)節(jié)pH 至6.0及8.0備用）；PBS緩沖液（pH＝7.4）；EDC/NHS（Sigma Corp，美國(guó)）；FJ－200高速分散均質(zhì)機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）；Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī)（eppendorf，德國(guó)）；倒置熒光顯微鏡（Olympus CKX41，日本）；Malvern激光粒徑測(cè)量?jī)x（3000SSA型，美國(guó)）。

1.2普通高分子納米微球的制備 稱量100mg的PLGACOOH，將其充分溶解于2mL二氯甲烷溶劑中（連續(xù)相），然后加入一定比例的雙蒸水（分散相），聲振30s后，將其倒入適量4%聚乙烯醇（PVA）溶液中，高速均質(zhì)5min，再加入20mL 2%異丙醇溶液，室溫下磁力攪拌2～5h，使微球表面固化。然后加入雙蒸水與正己烷以3 000r/min離心，多次洗滌，收集微球，冷凍干燥48h后，即得PLGA－COOH高分子納米微球凍干粉，放入4℃冰箱中保存。

1.3靶向高分子納米藥物的制備 將上述步驟制備得到的高分子納米微球分散溶解在適量的 MES緩沖液（0.1mol/L，pH＝6.0）中，然后加入一定量的EDC/NHS，室溫振蕩孵育30 min，然后加入雙蒸水，以3 000r/min的速度反復(fù)離心洗滌3次。再將洗滌后的高分子納米微球與TSH抗體同時(shí)分散溶解在適量的 MES緩沖液（0.1mol/L，pH＝8.0）中，室溫下振蕩孵育1～2h，再經(jīng)多次離心洗滌后，得到靶向高分子納米藥物（觀察組）。對(duì)照組的制備：制備方法同上，中間不加偶聯(lián)劑EDC/NHS，制備成對(duì)照高分子納米藥物，以排除抗體靜電吸附在納米顆粒上引起的靶向。

1.4靶向高分子納米藥物一般性質(zhì)檢測(cè) 光鏡電鏡下觀察微球的形態(tài)、分布，激光測(cè)徑儀檢測(cè)其粒徑大小和分布。

1.5TSH受體定位及表達(dá)的免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人甲狀腺癌細(xì)胞（FTC－133）以1×104/孔的密度加入裝有蓋玻片的6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)滿蓋玻片的70%～80%時(shí)，換液后加入稀釋好的rhTSH，37℃孵箱中過(guò)夜。將6孔板中的培養(yǎng)液用干凈吸管吸出，用PBS緩沖液漂洗3次，以排除培養(yǎng)液對(duì)結(jié)果的可能影響。最后用4%多聚甲醛原位固定10～15min，將多聚甲醛吸出，用PBS緩沖液漂洗3次。將上述制備好的細(xì)胞爬片經(jīng)熒光免疫方法驗(yàn)證甲狀腺癌細(xì)胞（FTC－133）上TSH受體的表達(dá)情況。具體操作步驟：（1）將上述已固定好的細(xì)胞爬片用PBS洗3次，搖床振搖每次5min。（2）0.3%H2O2浸泡室溫放置30min。（3）PBS洗3次，搖床振搖每次5min。（4）1%羊血清＋PBS＋鼠抗人TSH單克隆抗體（1∶40），4℃孵育2～4h。（5）PBS洗3次，搖床振搖每次5min。（6）兔抗鼠TSH二抗（1∶80Antimouse body FITC），37℃恒溫1～2h。（7）PBS洗3次，搖床振搖每次5min。（8）DAPI（1∶500），5～10min。（9）PBS洗3次，搖床振搖每次5min。（10）吹干，用30%甘油封片。（11）熒光顯微鏡下進(jìn)行圖像采集、分析。

1.6靶向高分子納米藥物的體外尋靶實(shí)驗(yàn) 同上制備細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁后，加入0.9mg/mL rhTSH，37℃孵箱中過(guò)夜。預(yù)設(shè)為普通高分子納米微球和靶向高分子納米微球，每組各3片細(xì)胞爬片。將過(guò)夜后的細(xì)胞爬片在細(xì)胞操作臺(tái)上吸干培養(yǎng)液，并用PBS洗滌3次，于3孔內(nèi)各加入200mL靶向高分子納米藥物，另3孔內(nèi)各加入200mL對(duì)照組高分子納米藥物。然后再每孔追加2mL DMEM－F12培養(yǎng)液，并于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～2h，最后以PBS沖洗每張蓋玻片6次，光鏡下觀察高分子納米藥物與細(xì)胞的結(jié)合情況。

2 結(jié) 果

2.1靶向高分子納米藥物的一般特性檢測(cè) 采用本方法制備出的PLGA－COOH靶向高分子納米藥物，外觀呈白色粉末狀物質(zhì)，平均粒徑約為533.8nm。納米藥物水溶性好，用生理鹽水復(fù)容后光鏡、電鏡下觀察可見(jiàn)，其形態(tài)規(guī)則、呈球形，表面光滑，大小基本均勻，分散度好，微球間無(wú)明顯粘連、聚集現(xiàn)象，見(jiàn)圖1、2。

圖1 靶向放射性納米藥物光鏡圖像

2.2免疫熒光檢測(cè) 熒光顯微鏡下觀察，F(xiàn)TC－133細(xì)胞呈梭形，中心暗區(qū)是細(xì)胞核，核周?chē)G色亮區(qū)即是TSH受體分布和表達(dá)部位（圖3A），細(xì)胞核DAPI染色成藍(lán)色（圖3B）。

圖2 靶向放射性納米藥物電鏡圖像

圖3 FTC－133細(xì)胞表面TSH受體表達(dá)及定位

2.3靶向高分子納米藥物體外靶向能力檢測(cè) 觀察組靶向高分子納米藥物與FTC－133的結(jié)合情況，大量靶向高分子納米藥物能夠牢固的與FTC－133相結(jié)合，緊密聚集在細(xì)胞周邊（圖4A）。對(duì)照組高分子納米藥物與FTC－133的結(jié)合情況，F(xiàn)TC－133周?chē)匆?jiàn)普通高分子納米藥物與之結(jié)合（圖4B）。

圖4 光鏡下靶向放射性納米藥物體外細(xì)胞尋靶圖像

3 討 論

甲狀腺癌發(fā)病率不斷增加，目前仍缺乏明確有效的治療方法，盡管通過(guò)手術(shù)聯(lián)合131I及TSH抑制的治療，很大程度地提高了患者的生存率。但因其病理學(xué)上的異質(zhì)性，易發(fā)生退行性改變，失分化程度不同等因素，導(dǎo)致甲狀腺癌細(xì)胞膜表面的功能性蛋白表達(dá)降低或無(wú)表達(dá)，使得甲狀腺癌的攝碘能力降低、對(duì)131I抵抗，降低了治療的效果，使得甲狀腺癌的治療仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)［2－4］。

TSH從多方面調(diào)控甲狀腺的功能，如：吸碘作用、甲狀腺球蛋白的合成和分泌、甲狀腺素的釋放等［5］。rhTSH（蛋白多肽，商品化，可以臨床應(yīng)用）：rhTSH目前采取基因轉(zhuǎn)染倉(cāng)鼠而能夠穩(wěn)定表達(dá)，臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期試驗(yàn)已被證實(shí)是安全有效的。2009年美國(guó)甲狀腺指南已推薦rhTSH作為131I，去除甲狀腺癌術(shù)后殘存甲狀腺組織的常規(guī)用藥。本研究中通過(guò)TSH受體介導(dǎo)的靶向高分子納米藥物，為進(jìn)一步的甲狀腺癌靶向載藥治療打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。即通過(guò)TSH配體或抗體介導(dǎo)的放射性核素高分子納米材料藥物，特異性的結(jié)合甲狀腺癌細(xì)胞膜表面TSH受體，達(dá)到對(duì)甲狀腺癌病灶的特異性的靶向診斷，又能進(jìn)行特異性的靶向治療的雙重作用。

一直以來(lái)甲狀腺癌細(xì)胞或病灶的攝碘能力是甲狀腺癌診斷和制訂治療方案的基礎(chǔ)［6］，目的是通過(guò)甲狀腺癌細(xì)胞攝取131I，從而達(dá)到診斷和治療的目的，但目前的文獻(xiàn)報(bào)道，仍未見(jiàn)有效的方法。而本研究通過(guò)甲狀腺癌特異性靶點(diǎn)TSH受體的介導(dǎo)，首次將標(biāo)記或包載的放射性核素特異性結(jié)合到甲狀腺癌細(xì)胞上，結(jié)果顯示，TSH受體可以作為甲狀腺癌的特異性靶點(diǎn)；經(jīng)TSH受體介導(dǎo)的放射性高分子納米藥物，有潛在的特異性診斷和治療的作用。

目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道較多的有：鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（Na＋/I－symporter，NIS），主要存在于甲狀腺濾泡基底膜上的跨膜糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞外碘進(jìn)入甲狀腺細(xì)胞，是甲狀腺激素合成的主要步驟。NIS基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)的研究和（或）甲狀腺過(guò)氧化物酶（Thyroidperoxidase，TPO）基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染DTC細(xì)胞（人乳頭狀、濾泡狀、未分化）及其他細(xì)胞株生物學(xué)的研究，都是通過(guò)增強(qiáng)NIS基因和蛋白表達(dá)，達(dá)到增加攝碘的能力，但目前的實(shí)驗(yàn)報(bào)道，由于NIS基因表達(dá)較低或蛋白非極性表達(dá)以及碘的有機(jī)化障礙，導(dǎo)致碘的排泌率增加，不能有效增加131I的滯留率。另NIS基因在甲狀腺細(xì)胞的定位對(duì)TSH有依賴關(guān)系，TSH存在時(shí)，則定位到細(xì)胞膜上，TSH不存在時(shí)則在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有分布。提示NIS在甲狀腺細(xì)胞中可能存在TSH依賴性的誘導(dǎo)表達(dá)［7－9］。

因此，TSH受體對(duì)131I不敏感、耐受或者低分化的DTC復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移病灶，仍然具有高特異性，是一個(gè)高特異性的靶點(diǎn)，TSH受體是DTC術(shù)后全身惟一的針對(duì)DTC和復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移病灶的高特異性靶點(diǎn)［10］，這也是本研究選擇TSH受體作為關(guān)鍵靶點(diǎn)的主要理由。

本實(shí)驗(yàn)所用高分子納米材料PLGA－COOH，是已獲FDA批準(zhǔn)可用于注射型藥物控釋劑的最常用材料之一，具有安全、穩(wěn)定、無(wú)毒副作用、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，且是包裹藥物的良好載體［11－13］，具有較高的藥物負(fù)載能力，允許將藥物包裹入納米顆粒內(nèi)［14］，前期研究制備了包裹放射性核素131I的PLGA納米顆粒，經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn)其形態(tài)規(guī)則，呈球形、實(shí)心，大小均勻，理化性質(zhì)穩(wěn)定，復(fù)溶后分散度好，無(wú)明顯的粘連、聚集現(xiàn)象，是一種理想載藥納米藥物。并通過(guò)放射性核素自顯影實(shí)驗(yàn)及放射性活度計(jì)驗(yàn)證了放射性核素的包裹及包封率情況。放射自顯影圖像清晰，可見(jiàn)載藥納米藥物形態(tài)規(guī)則，大小均勻，球形、球心黑色顯影。因高分子材料PLGA－COOH表面有大量羧基，而TSH單克隆抗體本身含有大量氨基，在一定條件下通過(guò)耦聯(lián)活化劑EDC/NHS的活化作用后，再通過(guò)碳二亞胺化學(xué)連接兩者的羧基與氨基以縮合成共價(jià)鍵的形式牢固的連接在一起。碳二亞胺化學(xué)連接法是將高分子納米藥物與TSH抗體通過(guò)共價(jià)鍵的方式連接，為一種十分穩(wěn)定的連接方法，不易受體內(nèi)環(huán)境的影響，為進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)成功制備了TSH受體介導(dǎo)的能夠特異性的靶向甲狀腺癌細(xì)胞的高分子靶向納米藥物，其形態(tài)規(guī)則，大小均勻，在體外與甲狀腺癌細(xì)胞（FTC－133）具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，為進(jìn)一步甲狀腺癌的體內(nèi)及臨床靶向藥物的研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

［1］Hanahan D，Weinberg RA.The hallmarks of cancer［J］.Cell，2000，100（1）：57－70.

［2］Wells SA，Gosnell JE，Gagel RF，et al.Vandetanib for the treatment of patients with locally advanced or metastatic hereditary medullary thyroid cancer［J］.J Clin Oncol，2010，28（5）：767－772.

［3］Verbeek HH，Alves MM，de Groot JW，et al.The effects of four different tyrosine kinase inhibitors on medullary and papillary thyroid cancer cells［J］.J Clin Endocrinol Metab，2011，96（6）：991－995.

［4］Davies L，Welch HG.Thyroid cancer survival in the United States：observational data from 1973to 2005［J］.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2010，136（5）：440－444.

［5］Elisei R，Schlumberger M，Driedger A，et al.Follow－up of low－risk differentiated thyroid cancer patients who underwent radioiodine ablation of postsurgical thyroid remnants after either recombinant human thyrotropin or thyroid hormone withdrawal［J］.J Clin Endocrinol Metab，2009，94（11）：4171－4179.

［6］Brassard M，Borget I，Edet－Sanson A，et al.Long－term follow－up of patients with papillary and follicular thyroid cancer：aprospective study on 715patients［J］.J Clin Endocrinol Metab，2011，96（5）：1352－1359.

［7］Chung JK，Youn HW，Kang JH，et al.Sodium Iodide Symporter and the Radioiodine Treatment of Thyroid Carcinoma［J］.Nucl Med Mol Imaging，2010，44（1）：4－14.

［8］Smith VE，Read ML，Turnell AS ，et al.A novel mechanism of sodium iodide symporter repression in differentiated thyroid cancer［J］.J Cell Sci，2009，122（18）：3393－3402.

［9］Matsumoto H，Sakamoto A，F(xiàn)ujiwara M，et al.Decreased expression of the thyroid－stimulating hormone receptor in poorly－differentiated carcinoma of the thyroid［J］.Oncol Rep，2008，19（1）：1405－1411.

［10］Zhang N，Chittasupho C，Duangrat C，et al.PLGA nanoparticle－peptide conjugate effectively targets intercellular cell－adhesion molecule－1［J］.Bioconjug Chem，2008，19（1）：145－152.

［11］Rao DA，F(xiàn)orrest ML，Alani AW，et al.Biodegradable PLGA based nanoparticles for sustained regional lymphatic drug delivery［J］.J Pharm Sci，2010，99（4）：2018－2031.

［12］Melancon MP，Li C.Multifunctional synthetic poly（L－glutamic acid）－based cancer therapeutic and imaging agents［J］.Mol Imaging，2011，10（1）：28－42.

［13］Cartiera MS，F(xiàn)erreira EC，Caputo C，et al.Partial correction of cystic fibrosis defects with PLGA nanoparticles encapsulating curcumin［J］.Mol Pharm，2010，7（1）：86－93.

［14］Farokhzad OC，Cheng J，Teply BA，et al.Targeted nanoparticle－aptamer bioconjugates for cancer chemotherapy in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（16）：6315－6320.