一株水貂阿留申病毒的分離鑒定及VP2基因序列分析1)

桑 宇 張段玲 錢毓斌 張彥龍

(東北林業大學，哈爾濱，150040)

水貂阿留申病(Aleutian Ddisease，AD)是由阿留申病毒(Aleutian disease parvovirus，ADV)引起的水貂慢性傳染性疾病，主要侵害水貂的免疫系統，以漿細胞彌漫性增生和持續性病毒血癥為特征［1－2］。AD在有水貂飼養的國家普遍存在，臨床上主要表現為水貂產仔量降低、死胎、流產、腎小球腎炎、動脈血管炎和肝炎，并導致成年水貂的免疫系統紊亂，仔貂突發嚴重肺炎而死亡［3］。病理剖檢常見腎腫大、充血而呈紅色，后變灰褐色或淡黃褐色，有的表面可見斑點狀出血，間有灰白色壞死灶［4］。水貂AD發病率約75%，直接死亡率可達30%［5］。病貂毛皮質量下降，對水貂養殖業造成巨大的經濟損失［6－7］。

對流免疫電泳(CIEP)是現今世界公認的并且應用最為廣泛的AD檢測方法，通過CIEP檢測淘汰AD陽性貂對貂群進行凈化，是目前AD防控唯一有效的方法。雖然我國已經研制出AD的CIEP診斷抗原，但由于我國水貂養殖方式和對AD危害認識不足等原因，AD檢測凈化一直沒有得到廣泛的推廣。近年，國際毛皮市場的旺盛需求帶動了我國水貂養殖規模的逐年擴大，但由于管理上的不完善等原因導致我國水貂ADV感染率居高不下，初步統計ADV的感染率高達80%～90%。AD對我國水貂養殖業健康發展的影響越來越嚴重，加強檢測凈化工作已經逐漸被廣大養殖場(戶)所認識和接受。為了深入了解近年來我國ADV的流行情況，并利用當前的流行毒株研制新的診斷抗原，筆者從送檢水貂樣本中分離出一株ADV(命名為ADV－ZYL1)，對其VP2序列進行測定，基于氨基酸的同源性繪制分析表，闡明ADV－ZYL1毒株的抗原變異情況，為進一步開展該病的診斷和防治研究奠定基礎。

1 試驗材料

病料 山東威海養殖戶送檢的疑似ADV感染致死的水貂樣本，采集其實質器官，置于－20℃保存。

試劑和細胞 蛋白酶K、PMD18－T載體購自寶生物工程(大連)有限公司;胰蛋白酶、DMEM購自Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、感受態大腸桿菌DH5α、小量膠回收試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司;小牛血清購自內蒙古金源康生物工程有限公司;貓腎傳代細胞系(CRFK)購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫;ADV陽性核酸為東北林業大學野生動物資源學院動物醫學實驗室保存。

引物 檢測用的特異性引物參考Qie等［8］的研究報告。上游P1:5'－CTTGTCACGCTACTAGAATGGT－3'(2 587 ～2 609 bp);下游 P2:5'－AGCTTAAGGTTAGTTTACATGGTTTACT－3'(3 252 ～3 279 bp)。可擴增的目的DNA片段的長度為693 bp。參考GenBank中保存的標準毒株ADV－G(M20036)核苷酸序列，利用引物設計軟件Oligo 6.0分別設計合成兩對引物，用于擴增 VP2全序列。上游AD1:5'－TATTCAGCAAGCAAAAAAGAAG－3'(2 336～2 355 bp);下游 DV1:5'－TTGGTTGGTATGAGTTAAGTAG－3'(3 921～3 942 bp)。擴增的目的片段命名為part.1，長度為1 606 bp。上游 AD2:5'－TATTCAGCAAGCAAAAAAGAAG－3'(3 810～3 831 bp);下游 DV2:5'－TATTCAGCAAGCAAAAAAGAAG－3'(4 452 ～4 474 bp)。擴增的目的片段命名為part.2，長度為664 bp。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

2 試驗方法

2.1 DNA的提取及PCR檢測

取水貂部分臟器，用剪刀盡量剪碎，加入600 μL 的1×TNE(消化緩沖液)，40 μL 蛋白酶 K，80 μL 10%SDS，55℃消化過夜。向各試管加入720 μL的平衡酚(V(酚)∶V(氯仿)=1∶1的混合溶液)，震蕩搖勻成乳濁液，放置0.5 h，4℃條件下12 000 r/min離心15 min。取700 μL上清液加入等體積的異丙醇，搖勻靜置30 min，4℃條件下12 000 r/min離心15min，棄上清。沉淀用75%預冷乙醇洗滌，12 000 r/min離心5 min，棄上清，干燥后加入10～20 μL滅菌純水。溶解后以紫外分光光度計定量為1 g/L。檢測引物P1、P2的PCR反應條件:94℃預變性 3 min，94 ℃ 0.5 min，50 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1 min，進行40個循環，最后72℃延伸7 min。反應結束后取5 μL擴增產物用1%瓊脂糖進行電泳，觀察結果。

2.2 病毒分離

將臟器置于研缽中并在冰上研碎，按研碎組織體積占據30%的比例加入DMEM制備組織懸液，懸液以12 000 r/min離心15 min，收集上清，以0.22 μm濾膜除菌后用于病毒的細胞培養。用含10%胎牛血清的DMEM培養液在37℃二氧化碳培養箱中培養CRFK細胞，細胞長成單層后傾去培養液，加入除菌組織懸液2 mL于31.8℃吸附2 h［9］，中間晃動數次，傾倒出吸附液，然后加入含10%胎牛血清的DMEM培養液，置于二氧化碳恒溫箱中31.8℃培養，以3～4 d作為標準，盲傳至出現病變后收獲各代病毒培養物。

2.3 分離病毒的PCR檢測和VP2全基因序列克隆測定

對出現病變后收獲的各代病毒培養物提取DNA，12 000 r/min 離心15 min，棄上清，加入490 μL的1×TNE(消化緩沖液)，10 μL 蛋白酶K，55 ℃消化過夜，其余步驟同2.1。以引物P1、P2進行PCR擴增，反應結束后通過瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。用兩對測序引物AD2、DV2和AD1、DV1分別對病毒分離前后的DNA進行PCR擴增。PCR采用25 μL體系。取2 μg DNA 作為模板，加入 10×Buffer 2.5 μL，上下游引物各1 μL、2.5 mmol/L 的 dNTP 2 μL、最后加0.5 μL 的 Taq 酶，用滅菌純水補足到25 μL。反應結束后分別進行電泳切膠回收，純化產物連接PMD18－T載體，轉化到感受態大腸桿菌DH5α，PCR檢測陽性單克隆菌落送英駿公司進行測序。測定結果編輯后用MEGA4.1和GenBank中國內外已發表的水貂阿留申病毒VP2蛋白氨基酸序列進行同源性比較。

3 結果與分析

3.1 病料的PCR初步檢測

提取幼貂臟器的DNA，并利用引物P1、P2進行PCR擴增。在脾臟DNA中得到了與預期擴增片段(693 bp)相符的核酸電泳帶，見圖1。

圖1 PCR檢測結果

3.2 病毒分離

將PCR檢測為陽性的脾臟碾磨過濾除菌，除菌后的組織懸浮液吸附于單層的CRFK細胞，31.8℃培養3代無明顯細胞病變，盲傳到第4代培養96 h后，細胞系出現嚴重的細胞脫落，并有大量空斑，形成CPE(cytopathic effect)。繼續在31.8℃條件下培養到第10代，仍見大量空斑和明顯的CPE(圖2)，凍融收集培養液。

圖2 分離毒株感染CRFK細胞后第10代96 h的形態觀察

3.3 分離病毒的PCR檢測及VP2序列測定

細胞培養物提取DNA后PCR檢測仍為陽性(圖3)，對病毒分離前后提取的DNA分別用AD1、DV1和AD2、DV2兩對引物進行擴增，得到了預期大小的擴增片段，見圖4。切膠純化后克隆測序表明，分離前后病毒序列無變化，登陸基因數據庫比對其測序結果，該結果與美國標準毒株ADV－G的VP2核苷酸同源性為94.7%，進一步證明了ADVZYL1為水貂阿留申病毒，而且此毒株可以在CRFK細胞中穩定生長。

圖3 病毒分離后培養液PCR檢測結果

3.4 ADV的VP2蛋白同源性比較

測序結果用DNAStar進行編輯。將編輯后ADVZYL1毒株的VP2基因與GenBank中的國際毒株ADV－Far East(DQ371395)、ADV－FIN(GQ336866)、ADV－G(M20036)、ADV－LN1(GU183264)、ADV－LN2(GU183265)、ADV －LN3(GU269892)、ADV －SL3(X97629)、ADV－TR(U39013)、ADV－TR2(U39014)、ADV－Utah－1(Z18276)的核苷酸序列進行同源性比較，見表1。結果顯示，ADV－ZYL1與其它亞型的毒株相比較，VP2蛋白氨基酸同源性為92.6% ～96.1%，其中與強毒力毒株ADV－Utah－1的親緣關系最近，與遠東毒株ADV－Far East的親緣關系最遠。

圖4 病毒分離前后培養液PCR檢測結果

4 結論與討論

本次試驗病料來源于斷乳前發病死亡的幼貂，通過病理學剖檢發現，其具有明顯臟器病變，表現為肺臟出血性炎癥，腎臟腫大、表面有出血點。細菌培養、犬瘟熱病毒和水貂病毒性腸炎等檢測結果均為陰性。應用已發表的特異性ADV引物進行PCR檢測呈陽性，因此認為幼貂由ADV感染致死。病料處理后在CRFK細胞連續培養10代后，獲得了穩定毒株ADV－ZYL1。利用設計的擴增VP2基因全序列的引物，分別對病料DNA提取物和病毒細胞培養物DNA進行VP2基因的測序，序列分析結果顯示，分離前后VP2同源性為100%，進一步驗證了病毒分離結果的可信度。

表1 11株ADV的VP2基因的氨基酸序列同源性分析結果

ADV的VP2蛋白由VP2基因編碼而成，在病毒衣殼中占有絕大部分的比重，是其主要抗原決定簇載體［11－12］，可以引起中和抗體反應［13］。人工表達的全VP2蛋白能獨立組裝成病毒衣殼，因此VP2基因的結構決定了病毒的抗原性［14］。近幾年的研究還表明，真核、原核表達的VP2全序列或者VP2片段都可直接用于ELISA和CIEP檢驗，表現出很好的抗原性［15］。對VP2核苷酸和氨基酸的研究有助于研究ADV抗原性，因此本次試驗選擇了對ADV－ZYL1毒株的VP2全序列氨基酸進行分析，結果表明:ADV病毒雖屬于細小病毒科，但是VP2蛋白的氨基酸突變率介于0.8%到8.8%之間，核苷酸突變率介于0.3%到7.7%之間，遠遠高于同屬于細小病毒科的水貂腸炎病毒和犬細小病毒［16－17］，而且突變氨基酸位點不僅集中在超變區，還廣泛存在于保守區，這與之前的報道相一致［18］。ADV－ZYL1毒株與同源性最近的毒株ADV－Utah－1有著24個氨基酸的差別，再次說明了阿留申病毒的氨基酸突變十分明顯。

盡管AD對水貂養殖業的危害巨大，但是目前國內外還未研制出有效預防本病的疫苗，只能通過CIEP檢驗血清淘汰病貂來實現對本病的控制和根除［10］。筆者的研究分析表明，ADV的核苷酸和氨基酸的突變率都很高，國內飼養水貂過程中ADV的基因在不斷突變，使用進口抗原進行AD檢測有可能會影響檢測的特異性和敏感性，使得出現假陰性的可能性增加，從而弱化了AD的凈化效果。

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