siRNA靶向沉默B7－H4基因對人前列腺癌DU145細胞增值和凋亡的影響

朱森良 孫曉青

1)徐州醫學院腫瘤實驗室 徐州 221002 2)徐州醫學院附屬醫院泌尿外科 徐州 221002

前列腺癌是老年男性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，以手術和內分泌治療為主。對于晚期、復發性或激素非依賴性的患者尚無有效治療方案。國內外許多學者都在探求基因水平的調控方法和尋找治療新靶點，以期在前列腺癌的治療上取得突破。B7－H4(也稱為B7x，B7S1)是最近發現的B7家族負性協同刺激分子［1－3］。近年來的研究發現B7－H4在多種腫瘤細胞中異常表達，可溶性B7－H4還見于腫瘤病人的血液樣本中，且與腫瘤發生、發展及預后狀況存在密切關系［4－5］，因此，認為B7－H4可能是腫瘤基因治療的分子靶點之一。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種雙鏈RNA分子在mRNA水平上誘發的轉錄后基因沉默機制(PTGS)［6］。由于RNAi對基因表達的阻斷具有高效、特異性，已迅速發展成為代替基因敲除的遺傳工具。目前已廣泛應用于泌尿系腫瘤生物治療的研究［7－9］。本研究應用siRNA沉默人前列腺癌DU145細胞的B7－H4基因，觀察其對DU145細胞增殖凋亡的影響，為前列腺癌的基因治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞株(人前列腺癌DU145細胞株購自中科院上海細胞研究所)。(2)主要試劑:3條B7－H4 siRNA及陰性對照siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成;Ham’sF12培養基購自Hyclone公司;胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司;LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司;(3)反轉錄試劑盒(Prime-Script RT reagent Kit)購自寶生物工程(大連)有限公司;(4)PCR試劑盒(Taq? Version 2.0)購自日本TaKaRa公司;(5)B7－H4和內參照β－actin引物由上海生物工程技術服務有限公司合成;(6)兔抗人B7－H4多克隆抗體購自Santa Cruz公司;(7)山羊抗兔IgG購自北京中山金橋有限公司;(8)CCK－8購自日本株式會社同仁化學研究所;(9)TRNzol總RNA提取試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)和AnnexinV/PI染色試劑盒均購自北京TIANGEN公司。

1.2 方法 細胞培養:DU145細胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的Ham’sF12培養，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞達到90%匯聚時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。在6孔細胞培養板中按細胞數3×105/孔接種細胞，每孔加入含10%FBS的Ham’sF12培養基在37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，轉染時細胞融合度達30% ～50%，棄去原培養液，用新無血清培養液輕洗2次，參照LipofectamineTM2000說明書進行細胞轉染。

1.2.1 siRNA 轉染:三條 B7－H4 siRNA:siRNA －1(897):Sense 5’－GCCCUUACCUGAUGCUAAATT－3’，Anti－sense 5’－UUUAGCAUCAGGUAAGGGCTT－3’;siRNA －2(446):sense 5’－GGCACCUACAAAUGUUAUATT－3’，Anti－sense 5’－UAUAACAUUUGUAGGUGCCTT－3’;siRNA －3(99):sense 5’－GGAGCAUAAUUAGCAUCAUTT－3’，Anti－sense 5’ －AUGAUGCUAAUUAUGCUCCTT－ 3’;negative control:Sense 5’－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－ 3’，Anti－sense 5’－ACGUGACACGUUCGGAGAATT－3’。實驗分5組:siRNA－1組，siRNA－2組，siRNA－3組，negative control(NC)組和空白對照組。將100 pmol siRNA用250 μL無抗生素、無血清的Ham’sF12培養液稀釋，輕混，室溫靜置5 min，在250 μL無抗生素、無血清Ham’sF12培養液中稀釋5 μL LipofectamineTM2 000轉染試劑，輕混，室溫靜置5 min，混合稀釋的siRNA和轉染試劑，室溫靜置20 min，將500 μL轉染復合物加入到6孔細胞培養板中，混勻，在37℃、5%CO2培養箱中培養，轉染6 h后更換含10%胎牛血清的Ham’s F 12培養液繼續培養，按照實驗的孵育時間分別收集細胞，進行后續試驗。

1.2.2 RT－PCR檢測B7－H4表達:由GenBank檢索目的基因序列，利用Primer－BLAST在線設計引物，序列如下:B7－H4上游引物5’－CACCAGGATAACATCTCTCAGTGAA －3’，下游引物5’－TGGCTTGCAGGGTAGAATGA －3’，產物長度 120bp。同時以β－actin作為內參照，上游引物5’－ACTCGTCATACTCCTGCT－3’，下游引物5’－GAAACTACCTTCAACTCC －3’，產物長度255bp。參照Trizol試劑說明書提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測定A280和A260值，計算其濃度和純度，每一樣品重復3次。利用oligo(dT)20引物和寶生物PrimeScript RT reagent Kit試劑盒逆轉錄成cDNA，在50 μL反應體系中按照PCR試劑盒(Taq? Version 2.0)說明書進行擴增，反應條件為94℃ 2min，98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 15 s，35 個循環，72℃ 5min。PCR 產物經2%瓊脂糖電泳檢測，電泳攝像儀掃描記錄攝影。結果用圖象處理儀(Gene Company)分析處理。測定各個條帶的灰度值，B7－H4條帶灰度值與其相應的β－actin條帶灰度值的比值作為各組間相互比較的參數。

1.2.3 Western blotting檢測B7－H4蛋白表達:收集轉染后的5組細胞，冷PBS沖洗2次后，RIPA裂解液提取細胞總蛋白，冰浴30 min裂解混勻、4℃ 12 000 r/min離心5 min后，BCA法行總蛋白測定，SDS－PAGE凝膠電泳后，半干轉印到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗(1∶500)，4℃孵育過夜，Washing buffer洗膜后，加入二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，Washing buffer洗膜后，NBT/BCIP顯色。內參照選用β－actin，電泳及轉膜條件同上，其他步驟相同，待NC膜晾干后掃描儀輸出結果，結果用圖象處理儀(Gene Company)分析處理。測定各個條帶的灰度值，B7－H4條帶灰度值與其相應的β－actin條帶灰度值的比值作為各組間相互比較的參數。

1.2.4 CCK－8檢測細胞增殖:轉染后將各組細胞胰酶消化離心，加入適量含10%FBS的Ham’sF12培養基后，調整其濃度為1×104/mL的單個細胞懸液，100 μL/孔的細胞懸液接種于3個96孔板，分3組:空白組、NC組和B7－H4－siRNA－3組，每組設3個時間點(24 h、48 h、72 h)，每個時間點設5個復孔，每孔100 mL。將各組細胞放入37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。每個時間點取出一塊相應的96孔板，向每孔加入10 μL CCK－8溶液。放入培養箱中繼續培養2 h后取出培養板，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(OD值)。取各孔平均值，繪制生長曲線。并計算細胞生長抑制率表示，細胞生長抑制率(IR)=(1－實驗組平均OD值/空白對照組平均OD值)×100%。

1.2.5 AnnexinV－FITC檢測細胞凋亡:轉染后細胞用冷的PBS洗滌2次，以1×107/mL的密度重懸細胞于1×binding buffer(含Ca2+)中，取100 μL細胞于1.5 mL塑料離心管中，加入5 μL Annexin V 和10 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)，輕輕混勻，避光室溫孵育15 min，每個樣品再加入400 μL 1×binding buffer，1 h內流式細胞儀檢測，AnnexinV－FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。獲取的數據用AnnexinV－FITC熒光強度為X軸，PI熒光強度為Y軸的散點圖分析。

1.3 統計學處理 用SPSS 13.0統計軟件處理，數據以均數±標準差(±s)表示，分析方法采用單因素方差分析(One－Way ANOVA)。假設檢驗水準按α=0.05判定，P＜0.05差異有統計學意義，所有實驗均至少重復3次。

2 結果

2.1 RT－PCR法半定量檢測DU145細胞B7－H4 mRNA的表達相對量(相對于β－actin mRNA) 結果顯示擴增片段大小與所設計的大小完全一致，分別為120bp和255bp。電泳結果可見siRNA－2和siRNA－3轉染組B7－H4 mRNA的表達水平有不同程度的下調，其相對量與空白對照組，NC組比較，差別有統計學意義(P＜0.05)，其中以siRNA－3轉染組下調最明顯(與siRNA －2組比，P＜0.05)，表達相對量約為 0.328 ±0.057。siRNA－1及NC組與空白對照組比較，差別無統計學意義(P＞0.05，見表1，圖1)

表1 RT－PCR檢測各組細胞B7－H4 mRNA的表達(± s，n=5)

表1 RT－PCR檢測各組細胞B7－H4 mRNA的表達(± s，n=5)

注:*P ＜0.05 vs空白組、NC 組;△P ＜0.05 vs siRNA－2

組別B7－H4 mRNA空白組0.778 ±0.091 NC 組 0.735 ±0.066 siRNA －1組 0.714±0.087 siRNA －2組 0.592±0.083*siRNA －3組 0.328±0.057＊△

圖2－1 RT－PCR檢測DU145細胞轉染各siRNA后B7－H4 mRNA表達Lane1:空白組;Lane 2:NC;Lane 3:siRNA－1;Lane 4:siRNA－2;Lane 5:siRNA－3

2.2 Western－blot檢測B7－H4蛋白表達水平 各組細胞Western－blot檢測分析表明，內參照β－actin為均一顯影條帶，siRNA－2和siRNA－3轉染組B7－H4蛋白的表達水平有不同程度的下調，其相對量與空白對照組及NC組比較，差別有統計學意義(P＜0.05)，其中以siRNA－3轉染組下調最明顯(與siRNA －2 組比，P ＜0.05)，表達相對量約為0.153±0.023，這與 RT－PCR結果相符合，因此確定siRNA－3為最佳干擾序列，進行后續實驗。siRNA－1及NC組與空白對照組比較，差別無統計學意義(P ＜0.05，見表2、圖2)。

表2 Western－blot檢測各組細胞B7－H4蛋白的表達 (±s)

表2 Western－blot檢測各組細胞B7－H4蛋白的表達 (±s)

注:*P ＜0.05 vs空白組、NC 組;△P ＜0.05 vs siRNA －2組

組別 n B7－H4蛋白空白組0.618 ±0.044 NC 組 5 0.595 ±0.041 siRNA －1 組 5 0.591 ±0.037 siRNA －2 組 5 0.457 ±0.033*siRNA －3 組 5 0.253 ±0.023 5＊△

圖3－1 Western－blot檢測轉染siRNA－1細胞B7－H4蛋白的表達Lane1:空白組;Lane 2:NC;Lane 3:siRNA－1;Lane 4:siRNA－2;Lane 5:siRNA－3

2.3 B7－H4基因沉默對DU145細胞增殖的影響 通過CCK－8法檢測細胞吸光度，根據吸光度來評估DU145細胞的增殖情況實驗結果顯示，siRNA－3組對DU145細胞增殖生長有明顯的抑制作用，在三個時間點，24 h、48 h和72 h的吸光度與空白組、NC組相比較，差別有統計學意義(P＜0.05)，而空白組與NC組相比，差別無統計學意義(P＞0.05，見表3、圖3)。轉染siRNA－3組DU145細胞生長抑制率24 h、48 h、72 h依次為(25.3±1.9)%、(30.6 ±2.1)%和(34.1 ±2.2)%，提示隨著時間的延長，DU145細胞增殖受到抑制效果增加。

表3 各組DU145細胞不同時間的OD值 (±s，n=5)

表3 各組DU145細胞不同時間的OD值 (±s，n=5)

注:*P ＜0.05 vs空白組、NC 組

時間 空白組 NC組 siRNA－3組24 h 0.419 ±0.031 0.403 ±0.026 0.313 ±0.020*48 h 0.493 ±0.024 0.482 ±0.023 0.342 ±0.022*72 h 0.651 ±0.029 0.668 ±0.022 0.429 ±0.019*

圖3 各組DU145細胞不同時間點的OD值(±s)

2.4 干擾B7－H4對人前列腺癌DU145細胞凋亡的影響 流式細胞儀雙參數圖上，Annexin V和PI均陰性為正常，Annexin V陽性、PI陰性為早期凋亡細胞，Annexin V和PI均陽性為凋亡后壞死細胞及部分壞死細胞，Annexin V陰性而PI陽性則為壞死細胞，實驗結果顯示，各組細胞繼續培養48h，siRNA－3組凋亡率為(28.43±1.29)%，與空白組和NC組相比凋亡率明顯增高(P＜0.05，見表4、圖4－1～圖4－3)，表明沉默 B7－H4基因的表達能促進DU145細胞的凋亡

表4 各組DU145細胞的AnnexinV－FITC染色流式細胞儀分析結果 (±s)

表4 各組DU145細胞的AnnexinV－FITC染色流式細胞儀分析結果 (±s)

注:*P ＜0.05 vs空白組、NC 組

組別 n 凋亡率/%空白組6.52 ±0.18 NC 組 3 6.74 ±0.21 siRNA －3 組 3 28.43 ±1.29 3*

圖5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

3 討論

機體抗腫瘤免疫主要是T介導的細細胞免疫。在T細胞活化和耐受的免疫調節中，B7－CD28家族成員介導的T淋巴細胞共刺激信號傳導途徑起著至關重要的作用。它們不僅在啟動、增強和維持T細胞應答中提供了關鍵的正性信號，而且還可提供重要的負性信號來限制、終止或削弱T細胞的免疫應答。B7家族能提供刺激或抑制信號調節T細胞的反應，這取決于B7家族哪種配體和受體作用于靶細胞［10－11］。B7－H4是最近發現的B7家族新成員，位于人的染色體1p11.1，編碼1個具有282個氨基酸的蛋白。體外T細胞增殖試驗證實B7－H4細胞能顯著抑制T細胞的增殖，能將T細胞阻滯在細胞增殖的G0/G1期，并降低IL－2、IL－4、IL－10和IFN－γ的分泌，尤其對IL－2更為顯著［1－12－13］。Miyatake等［14］發現乳腺癌組織中 B7 －H4 表達強度與浸潤性CD3+和CD8+T細胞的數量呈反比，提示B7－H4可抑制T細胞向腫瘤組織中趨化，從而介導腫瘤細胞的免疫逃逸。

B7－H4 mRNA廣泛分布于外周組織，但蛋白表達檢測陰性。說明正常外周組織B7－H4的表達在翻譯水平被嚴格調控，目前在多種惡性腫瘤組織及細胞株中均檢測到B7－H4異常高表達，Chen等［15］對112例食管鱗狀細胞癌(ESCC)患者的癌組織切片進行B7－H4檢測，發現B7－H4表達升高，并發現B7－H4表達強度與腫瘤轉移，TNM分期正相關，與CD3+T細胞和CD8+T細胞的密度負相關，認為B7－H4可能是ESCC免疫治療的潛在靶點。Qian等［16］發現B7－H4在前列腺癌組織中呈彌漫性高表達，而在正常組織中不表達，且腫瘤患者的B7－H4的表達水平隨患者腫瘤分級的增高而升高，但其與前列腺癌增殖和凋亡的關系還未見報道。

Salceda等［17］首次提出B7－H4在促進上皮細胞的惡性轉化中起著直接的作用，首先轉染B7－H4基因到B7－H4－的人卵巢癌細胞株中，發現能促進腫瘤在SCID小鼠體內的生長，并抑制腫瘤細胞的凋亡，利用siRNA下調人類乳腺癌細胞B7－H4 mRNA的表達可提高腫瘤細胞中caspase的活性并誘導腫瘤細胞的凋亡。本研究在證明所設計合成的siRNA能夠有效抑制B7－H4表達后，將這段siRNA轉染DU145細胞。結果顯示:在對干擾組進行轉染后，干擾組DU145細胞生長增殖明顯慢于空白對照組和陰性對照組，凋亡率明顯高于其他兩對照組。而兩個對照組之間的細胞生長情況則無顯著性差異。由此可以說明B7－H4的表達與DU145細胞的生長是具有相關性的。沉默B7－H4基因在一定程度上可誘導DU145細胞凋亡，發揮抗腫瘤效應。這與Salceda等的研究基本一致。B7－H4可能通過抑制T細胞活性，逃避機體的免疫監視或者直接抑制腫瘤細胞凋亡兩個方面促進腫瘤的惡性生物學行為。然而，B7－H4在促進腫瘤生長，抑制凋亡的準確作用還不是很清楚。

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