紫外線誘變在青霉素G生產菌種中的應用

張翼飛

（哈藥集團制藥總廠 黑龍江 哈爾濱 150086）

在青霉素G發酵生產菌種的制備過程中，菌種誘變篩選往往由于細胞壁的存在而影響其對外界理化因子的敏感性，因而我們采用細胞脫壁后再進行紫外線誘變處理的方法，選育高產優質菌種，大大提高了菌種細胞的變異率，加快了高產特性菌株的篩選過程，實踐證明該方法是行之有效的。

1 實驗材料

1.1 菌株

產黃青霉菌618#

1.2 培養基[2]

（1）斜面培養基（%）

甘油 0.75；甘油蜜糖 0.75；酵母浸處粉 0.5；NaCL 1;Ca-SO40.025;部分微量元素；瓊脂 2.7；pH 6.8

（2）菌絲培養基（%）

玉米漿 6.1；蔗糖 2.0；CaCO30.5（調 PH 后加入）；pH 5.8

（3）再生培養基（%）

NaNO30.3;MgSO4·7H2O 0.05;FeSO4·7H2O 0.001;KCL 0.05;KH2PO40.1;

葡萄糖 4；酵母膏 0.2；瓊脂 2.7；pH 6.8（用穩定劑配制）

（4）穩定劑

0.7 M NaCL

（5）種瓶培養基

以蔗糖、玉米漿為主要碳、氮源，pH5.8

（6）發酵瓶培養基

以乳糖、玉米漿為主要碳、氮源，加無機鹽類組成，pH5.9

1.3 酶

纖維素酶+cellulase R—10

2 實驗方法

2.1 原生質體的制備

（1）菌體培養

將618#菌種新鮮斜面加入適量無菌水，刮下菌株孢子制成孢子懸液，經玻璃珠打散過濾后取1mL接種于40mL的菌絲培養液中，28℃，240rpm條件下培養36h，得到菌絲體。

（2）胞壁酶處理

用4層無菌紗布過濾收集菌絲體，無菌水洗2-3次，再用穩定劑洗兩次，取1g左右的菌絲體懸浮于5mL穩定劑中，加入5mg纖維素酶和5mg cellulase R-10，30℃恒溫水浴振蕩搖床60rpm，1.5-2h，鏡檢有大量原生質體釋放后，用200目尼絨網濾除菌絲碎片和未酶解的菌絲體，濾液經1000rpm離心5min，棄上清，加10mL穩定劑重復離心兩次，加入5mL穩定劑懸浮原生質體，備用。

2.2 紫外線誘變處理原生質體

取原生質體懸浮液適量，進行紫外線（253.7nm）誘變處理，分別照射 25′′和 40′′。

2.3 高產菌株的檢出

將處理后的原生質體懸浮液涂于再生培養基平皿中，t=25℃，Φ=45±5%，恒溫培養7天。帶菌落長出后，挑選結構緊密，形狀規則的單菌落傳斜面培養后，進行發酵搖瓶的篩選。

3 實驗結果

3.1 紫外線對原生質體的致死作用

我們對產黃青霉菌618#進行了紫外線處理，并分別采用25′、40′的計量處理原生質體，由表1可以看出，隨著照射時間的增加，致死率也相應提高。

表1 致死率

3.2 發酵相對效價與相對產量的變化

經搖瓶發酵篩選得到701#菌種，該菌種在發酵效價與總產量方面均高于出發菌株618#（表2）。

表2 兩菌株發酵相對效價及相對產量

3.3 限氧條件下的搖瓶考查

用改變瓶口紗布層數來改變供氧的方法考查76#菌株在限氧條件下發酵效價的變化情況（表 3）。

由表3可以看出，隨著紗布層數的增加、供氧量的減少，701#菌株的發酵效價變化不大。

表3 不同限氧條件下發酵效價變化

3.4 單位菌絲合成能力的比較

單位菌絲合成能力的比較是考查一個新菌株是否有推廣生產價值的主要參數之一，為此我們將菌株701#和菌株618#進行了對比考查（表4）。

表4 兩菌株單位菌絲合成能力比較

從表3可以看出701#菌株單位菌絲的青霉素合成能力明顯高于618#菌株。

3.5 穩定性考查

將701#菌株傳代后，進行搖瓶考查，結果表明其F1代、F2代、F3代發酵效價與總產量均無明顯變化，說明該菌株的穩定性較好。

4 討論

本試驗采用的方法篩選青霉素高產菌株，試驗證明，產黃青霉菌的細胞壁被去除后，對紫外線的敏感度增強，隨著照射時間的增加，致死率相應提高，在引起絕大多數原生質體致死的同時，存活個體中的變異頻率大大提高，處于對數生長期的菌絲體最容易酶解，通過搖瓶篩選我們得到701#菌株，該菌株除發酵效價和總產量有所提高外，對氧的需求也有所降低，取得了很好的效果。

［1］熊宗貴.發酵工藝與原理[M].中國科學技術出版社.

［2］翁艷軍.青霉素產生菌的原生質體融合[J].中國抗生素雜志，2003，3：129-130.