纖維蛋白膠對骨髓源性心肌干細胞增殖、遷移和缺血缺氧后的保護作用1）

國海東，譚玉珍，邵水金，崔曉軍，朱 晶，張黎聲，姜 俊，陸萍萍

動物實驗和初期臨床研究已證實干細胞移植能夠修復壞死心肌，并在一定程度上改善心功能［1］。然而，由于心肌梗死后局部缺血、缺氧和產生氧化應激，致使移植細胞在不利微環境內存活能力低下和不能有效地向心肌細胞分化，從而嚴重地影響了干細胞移植的治療效果［2］。纖維蛋白膠（fibrin glue，FG）是纖維蛋白原在凝血酶的作用下形成的一種天然生物材料。FG不僅具有良好的生物相容性和生物可降解性，還可以通過降解產物纖維蛋白E片段誘導新血管形成［3］。FG可利用病人自身血液成分制備，能夠避免免疫源性，已獲得FDA批準并廣泛應用于臨床外科領域。FG承載骨骼肌成肌細胞或骨髓單個核細胞（BMMNC）等移植治療心肌梗死，能夠減少梗死面積，促進細胞存活和血管新生，有利于心功能的改善［4－7］。然而，并不能促進梗死部位的心肌再生，這可能與移植細胞很少甚至不能向心肌分化有關。由于骨髓源性心肌干細胞（marrow－derived cardiac stem cell，MCSC）具有特異性心肌分化潛能［8，9］，應用 FG 承載MCSC移植治療心肌梗死有望達到理想的治療效果。因此，本文首次研究了FG對MCSC增殖、遷移和存活的作用，為臨床應用干細胞移植治療心肌梗死等缺血性疾病提供實驗手段和理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SD大鼠由復旦大學實驗動物中心提供；DMEM培養基、胰酶、多聚賴氨酸、熒光活性染料DiI、纖維蛋白酶和凝血酶均購自美國Sigma公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；吖啶橙（acridine orange，AO）和溴乙啶（ethidium brimide，EB）購自華美生物工程公司；無糖DMEM購自美國Gibco公司；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自日本Diagnostic Chemicals公司。

1.2 方法

1.2.1 MCSC的培養 參考成熟的實驗方法［8］。將成年雄性SD大鼠拉頸處死，在無菌條件下剔出雙側股骨和脛骨。切除骨兩端的干骺端，暴露骨髓腔，用含有肝素的PBS沖洗骨髓腔，收集沖洗液后離心。用DMEM培養液混懸沉淀細胞，均勻接種到培養瓶中。當細胞達到70%～80%匯合時，經胰酶消化后收集細胞。用添加15%FBS的DMEM充分混懸沉淀細胞，使細胞分散成單細胞懸液。顯微鏡下計數細胞后，將單細胞懸液用培養液稀釋，以10倍等階式稀釋的方式將單細胞懸液稀釋至細胞密度為103個／mL。取0.1mL稀釋后的細胞懸液加入10 mL培養液，使最終細胞密度為10個／mL。將稀釋好的細胞懸液加入96孔細胞培養板，每孔150μL，進行單細胞克隆培養。通過多能干細胞標志物c－kit的免疫熒光標記和早期心肌形成轉錄因子Nkx 2.5的RT－PCR檢測，篩選具有特異心肌分化潛能的MCSC。

1.2.2 FG－MCSC的制備 取第8代MCSC，用PBS浸洗后，在37℃下用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液消化1min，收集細胞，離心（1 000r／min，8min）。棄去上清液，加入纖維蛋白原重新懸浮。然后將50μL細胞懸液緩慢滴加至96孔培養板中，隨即在含有細胞的纖維蛋白原液體上面滴加50 μL濃度為5U／mL的凝血酶，輕輕回蕩和傾斜培養板，使兩者混勻，放入培養箱20min使其完全膠化，形成FG－MCSC混合物。加入含15%FBS的DMEM進行培養。

1.2.3 細胞在不同濃度FG中的生長 FG－MCSC的制備同

1.2.2 。實驗分兩組：高濃度FG組和低濃度FG組。高濃度FG組為20mg／mL纖維蛋白原形成的FG；低濃度FG組為5mg／mL纖維蛋白原形成的FG。通過AO／EB染色觀察MCSC在不同濃度FG中的生長。取各組培養后7d細胞，加入AO／EB染色液。在Olympus熒光顯微鏡下觀察細胞形態和著色。選擇合適濃度的FG用于后續實驗。

1.2.4 細胞增殖實驗 取第8代 MCSC，在37℃下用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液消化1min，收集細胞，離心（1 000r／min，8min）。吸取0.5mL密度為2×105個／mL的細胞懸液，加入1.5mL PBS，再加入4μL DiI染料，在4℃條件下靜置10min。清洗未結合的DiI染料后，用5mg／mL的纖維蛋白原懸浮細胞，在96孔培養板中制備FG－MCSC。加入15%DMEM進行培養。實驗重復3次，每孔隨機選取5個視野，在培養后2h、1d、2d、3d、5d和7d分別在熒光顯微鏡下計數紅色熒光細胞數目。

1.2.5 細胞遷移實驗 在損傷實驗，制備FG－MCSC，放入培養箱中放置20min，使其完全膠化，用刀片切除膠的一部分，加入15%DMEM進行培養。在培養后1d、2d和3d分別在相差顯微鏡下觀察從切除邊緣向外遷移的細胞。

在遷移實驗，制備FG－MCSC，放入培養箱中放置20min，使其完全膠化，不對FG－MCSC進行損傷處理，加入15%DMEM進行培養，在培養后1d、2d和3d分別在相差顯微鏡下觀察細胞從FG自然邊緣向外遷移的細胞。

1.2.6 體外缺血缺氧模型的建立 參照Hori等［10］的方法自制缺氧裝置，并加以改進，建立體外缺氧缺糖（OGD）模型在密封的有機塑料盒的兩端各建立一個通氣孔，分別為進氣孔和排氣孔。進氣孔連接含有95%N2和5%CO2的混合氣體源，排氣孔用以抽空氧氣和連接測氧儀。實驗分FG－MCSC OGD組、MCSC組、MCSC OGD組。MCSC組為正常培養組。在MCSC OGD組和FG－MCSC OGD組，吸去培養液，用0.01 mol／L PBS清洗3次，更換無糖無血清的DMEM。將培養皿放入缺氧盒中，關閉通氣孔后，經排氣孔將缺氧盒中的氣體抽空。然后，關閉排氣孔，經通氣孔通入體積分數為5%CO2和95%N2的混合氣體，并用測氧儀檢測盒中的氧氣含量。當氧濃度小于1%時封閉兩孔。將缺氧盒放入37℃培養箱內進行缺血缺氧處理。

將FG－MCSC OGD組和MCSC OGD組的細胞缺血缺氧處理12h后，加入AO／EB染色液，在熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態和著色。每孔隨機選取5個視野，分別計數存活、凋亡、壞死細胞。實驗重復3次，計算存活、凋亡和壞死細胞所占細胞總數的比例。

1.2.7 LDH的檢測 細胞凋亡或壞死可以造成細胞膜結構的損害或完全裂解，從而導致細胞內的LDH釋放外泄進入培養液。LDH泄漏法的測定是基于在乳酸脫氫酶的作用下使四唑鹽染料碘硝基氯化四氮唑還原為紅色甲臜，通過比色法定量測定酶含量，以評價細胞損傷程度。將FG－MCSC OGD組和MCSC OGD組細胞缺血缺氧處理12h后，取出培養板，分別從培養板各孔吸取上清100μL，加到反應板孔中，37℃放置10 min。配制乳酸脫氫酶底物溶液：氧化型輔酶I 10mg，PMS 2 mg，NBT 5mg，用蒸餾水2mL溶解，混勻，靜置5min。取上部溶液1.5mL，加入0.4mL 1mol／L乳酸鈉溶液。用0.1mol／L pH7.4的磷酸緩沖液定容到10mL。每孔加入新鮮配制的底物溶液100μL，室溫避光反應15min，然后每孔加入25μL檸檬酸液終止酶促反應。在酶標儀570nm波長下讀取各孔OD值，計算各個樣本的平均值。

1.3 統計學處理 采用SPSS 15統計軟件處理數據，數據用均數±標準差（x±s）表示，各組間的差別采用單因素方差分析進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度FG對MCSC黏附和存活的影響（見表1） 高濃度FG幾乎不透明，有一定的彈性和機械強度，經牽拉不易變形。而低濃度FG為一種透明的凝膠，彈性較高，但機械強度較差，機械牽拉極易導致凝膠變形。將MCSC接種到高濃度FG內，細胞伸展受限。MCSC在低濃度FG內培養2h，相差顯微鏡下可見MCSC在FG內均勻散在分布，少數細胞已開始伸展。培養24h后，大部分MCSC鋪展，呈現成纖維細胞樣形態。在FG中培養7d后，高濃度FG組MCSC的數目較少，細胞增殖不明顯，且細胞伸展欠佳；在低濃度FG組，培養7d后 MCSC的數量明顯增多，細胞呈成纖維細胞樣，伸展良好，未出現明顯的凋亡或壞死。

表1 不同濃度FG培養7d后存活細胞數目（x±s） 400×視野

2.2 MCSC在FG中的增殖（見表2） 接種后2h，MCSC在FG內均勻散在分布，少數細胞已開始伸展。接種后1d～7d，FG組大部分MCSC細胞保持正常的形態，具有較好的活力。而在單獨MCSC組，接種后5d～7d，可見上清液中出現部分漂浮細胞。通過比較DiI標記的細胞數目發現，MCSC在FG內能夠保持較好的增殖能力，在接種后5d和7d，與MCSC組相比，細胞數目顯著增加。

表2 MCSC在FG中的增殖（x±s）200×視野

2.3 MCSC在FG中的遷移（見表3） 損傷實驗結果發現，接種后1d和2d，僅有少量細胞從FG的刮除線邊緣遷出。在接種后3d，有大量細胞從FG中遷出。在遷移實驗中，接種后1 d，有許多細胞從FG自然形成的邊緣遷出。接種后2d和3d，有更多的細胞自FG的自然邊緣遷移到FG外。

表3 MCSC從FG邊緣遷出的細胞數目（x±s） 200×視野

表4 缺氧缺糖處理后MCSC存活、凋亡和壞死的數目和上清液中LDH的水平（x±s）

2.4 FG對MCSC的保護作用（見表4） 正常培養的 MCSC很少發生凋亡或壞死，而經缺氧缺糖處理12h后，在 MCSC OGD組，大部分MCSC細胞核表現出明顯的凋亡或壞死形態變化。與MCSC OGD組相比，FG－MCSC OGD組MCSC的存活數目較高，凋亡和壞死細胞數目較低。MCSC經缺氧缺糖處理后可釋放大量LDH，上清液中LDH的水平顯著升高，雖然FG－MCSC OGD組LDH的水平仍高于MCSC組，但明顯低于MCSC OGD組。

3 討 論

生物材料是一類具有特殊功能的，用于機體組織修復和再生的材料［11］。生物材料能夠促進細胞黏附、存活和分化，對優化干細胞移植微環境和提高干細胞移植治療心肌梗死的效果具有重要的臨床指導意義。在多種生物材料中，FG具有較大的優勢，它可以從病人自身血液制備，能夠避免免疫反應，并且可重復性好，已廣泛用于外科領域的止血和創傷修復［3］。本研究發現，在接種后7d內，MCSC在FG中能夠保持較高的活力。通過比較DiI標記的細胞數目，發現MCSC在FG內能夠很好地增殖。以上結果表明，FG具有很好的生物相容性，FG可以為MCSC提供一個良好的生長微環境，并且5mg／mL纖維蛋白原形成的低濃度FG比高濃度的FG更適合細胞的生長與增殖。

我們首次通過體外建立缺血缺氧模型，研究FG對MCSC抗缺血缺氧的保護作用。經缺血缺氧處理12h后，MCSC OGD組大部分MCSC細胞核表現出明顯的凋亡或壞死形態變化。而FG－MCSC OGD組大部分細胞仍保持較好的形態，凋亡或壞死的細胞數目明顯較少。LDH泄漏法可以定量反映細胞膜的損傷程度。缺血缺氧處理可以導致MCSC中LDH的大量釋放。在MCSC組，上清液中LDH的水平顯著升高，而FGMCSC OGD組LDH的水平比MCSC OGD組明顯較低。以上結果提示，缺血缺氧可以導致MCSC發生明顯的凋亡和壞死，而FG有助于細胞抵抗缺血缺氧微環境，提高其存活能力。FG提供的三維微環境可以直接促進MCSC的存活。FG也可通某些特異性配體，與MCSC表面受體結合，進而激活下游信號傳導通路，發揮保護細胞抵抗缺血缺氧的作用。另外，FG也可能通過影響MCSC的旁分泌間接促進MCSC的存活。最近的研究表明，生物材料可以與干細胞發生相互作用，提高干細胞胰島素樣生長因子－1和肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）等細胞因子的釋放［12］。由于生物材料的緩釋的作用，這些細胞因子能較長時間的停留在生物材料中，對于細胞的存活可能發揮間接的調控作用［13］。然而，FG促進MCSC存活的具體作用機制尚需進一步研究。

干細胞在注射部位的“局限化”和不能向梗死部位的遷移也是干細胞移植面臨的問題之一。單純自體骨骼肌成肌細胞移植后，在梗死區可以觀察到移植細胞成簇位于瘢痕組織之間。并且，由于這些細胞位于孤立的區域，可能形成一個促心律失常的異質環境，影響正常的興奮傳導［14］。有文獻報道，在體外骨髓間充質干細胞能夠從FG中遷出［15］。本研究也發現，在損傷實驗，接種后3d，有大量細胞從FG中遷出。在遷移實驗中，接種后1d就有很多細胞從FG中遷出，并且隨著時間的推移，可見大量細胞自FG的自然邊緣遷移到FG外。本研究結果表明，FG能夠保護MCSC免受缺血缺氧造成的凋亡或壞死，MCSC在FG內很好的存活，并能夠從FG中遷出，這將有利于MCSC移植后向梗死區的遷移和分布，為FG承載MCSC移植治療心肌梗死奠定了基礎。

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