重組人促紅細胞生成素對急性腦缺血大鼠腦梗死體積及Nrf2、HO－1表達的影響1）

郭軍紅，孟華星，嚴 澎

氧化應激在急性缺血性腦損傷中發揮了重要的作用［1］。近年來有大量研究證實，重組人促紅細胞生成素（rhEPO）在缺血性腦損傷中發揮了抗氧化作用［2］，但其作用機制仍不清楚。本研究采用大鼠永久性局灶性腦缺血（pMCAO）模型，通過對缺血腦組織中腦梗死體積、核因子E2相關性因子2（Nrf2）及血紅素加氧酶（HO－1）表達的研究，探討rhEPO在缺血性腦損傷的抗氧化作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 36只健康雄性SD大鼠（山西醫科大學實驗動物中心提供），體重230g～270g。

1.2 藥品及試劑 重組人促紅素注射液（北京四環生物制藥有限公司），Nrf2、HO－1兔抗鼠多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司，免疫組化用），PV－6001二步法免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），辣根過氧化物酶標記的二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 分組 隨機將36只SD大鼠分為假手術組（n＝12）、缺血組（n＝12）和rhEPO治療組（n＝12）。每組隨機選取6只行免疫組化。

1.4 模型制作與取材

1.4.1 模型制作 采用改良的Zea－Longa法［3］制備pMCAO模型。大鼠在術前24h禁食，術前4h禁水，10%的水合氯醛（0.35mL／kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位，取頸正中切口，暴露并鈍性分離左側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA）。結扎ECA遠端、CCA近心端，用動脈夾夾住ICA，在CCA近分叉處約5mm處剪一“V”型小口，將預先準備好的直徑約0.26mm的蘸有石蠟的尼龍線頭輕輕插入CCA，從CCA分叉處計算，插入18mm～20mm時稍遇阻力即可停止，并結扎CCA，逐層縫合筋膜、皮膚，建立pMCAO模型。假手術組除插入魚線約10mm外，其余操作與缺血組相同。rhEPO治療組在缺血2h時腹腔注射rhEPO 5 000IU／kg，假手術組與缺血組則給予等量的生理鹽水。參考Zea Longa評分標準，評分為0分和4分者均剔除。缺血24h后處死大鼠。

1.4.2 取材 造模完成后，各組隨機取6只在相應時間點心臟灌注去血后，斷頭取腦，經10%中性甲醛固定24h后，取視交叉后1mm～4mm腦組織，石蠟包埋，切片行免疫組化。

1.5 腦梗死體積的測量 大鼠在缺血24h后以10%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，以生理鹽水沖洗后，將腦組織迅速置于－20℃冰箱凍存20min后取出，去除嗅球、小腦和低位腦干，切除額極和枕極，以2mm間距行冠狀位切片，共5片，然后浸于2%的TTC（2，3，5－氯化三苯基四氮唑）磷酸鹽緩沖液中，置于37℃的水浴箱中染色30min，再在4%的多聚甲醛溶液中固定12h，取出后用數碼相機照相，最后利用圖像分析軟件計算出梗死區域的面積，為了消除腦水腫的影響，梗死區域體積用占對側大腦半球體積的百分比來表示。

1.6 免疫組化檢測Nrf2及其HO－1的表達 免疫組化方法嚴格按說明書染色步驟進行，抗原修復后，孵育一抗，Nrf2和HO－1兔抗鼠多克隆抗體分別按1∶100和1∶200稀釋。每片在高倍鏡（400倍）下隨機選取損傷側（左側）皮層范圍內5個非重疊視野，利用Image－Pro Plus軟件計算平均陽性細胞數。1.7 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件包進行分析，數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析和Student－Newman－Keuls（SNK－q）檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦梗死體積比較 TTC染色結果：腦組織梗死灶呈白色，正常組織呈紅色，部分組織表現為由白色向紅色過渡區。缺血組左側半球梗死灶主要位于額頂葉皮質及紋狀體。假手術組無梗死體積。與缺血組相比，rhEPO治療組腦梗死體積明顯減小，有統計學意義（P＜0.01）。詳見表1。

表1 各組大鼠腦梗死體積比較（x±s）

2.2 免疫組化測定腦組織中Nrf2及HO－1的分布與表達 假手術組可見HO－1在細胞漿中有少量表達；缺血組陽性細胞增多，陽性細胞主要為缺血區的神經元和星形膠質細胞。與假手術組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）；rhEPO治療組陽性細胞增多更為明顯，與缺血組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

假手術組中有少量Nrf2漿陽性細胞，無明顯核陽性細胞。缺血組可見明顯的Nrf2核陽性細胞，核陽性細胞主要為缺血區的神經元和星形膠質細胞。與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；rhEPO治療組可見大量的核陽性細胞，與缺血組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。表明rhEPO能增加核內Nrf2的含量。詳見表2。

表2 各組大鼠Nrf2、HO－1陽性細胞數比較（x±s）

3 討 論

Nrf2是新近發現的一種對氧化應激非常敏感的基因轉錄因子，Nrf2的缺失或激活障礙，會使細胞對氧化應激的敏感性提高［4］。卒中發生前Nrf2的激活能夠清除缺血半暗帶區的自由基。HO－1是一種重要的抗氧化酶，又稱熱休克蛋白32（HSP32），在各種理化因素如發熱、氧化應激等狀態下，可在腦中大量被誘導、表達，從而發揮作用。rhEPO在缺血性腦損傷中具有抗氧化作用，但其抗氧化作用機制是否與Keap1－Nrf2／ARE抗氧化系統有關，尚不清楚。

本研究通過觀察大鼠局灶性腦缺血模型Nrf2及HO－1的表達，進一步探討rhEPO的抗氧化作用機制。免疫組化結果證實，假手術組有少量的Nrf2和HO－1陽性細胞；缺血組Nrf2核陽性細胞和HO－1陽性細胞增多，提示急性腦缺血發生后，Nrf2與Keap1分離，轉位進入胞核，進而與核內的ARE結合，上調HO－1；rhEPO治療組與缺血組相比，Nrf2核陽性細胞和HO－1陽性細胞明顯增多，提示rhEPO可能促進了Nrf2的核轉位。本研究表明，腦缺血發生后，腦中Keap1－Nrf2／ARE抗氧化系統被激活，rhEPO可能通過激活該抗氧化系統來發揮抗氧化作用。

假手術組中有少量的陽性細胞，表明機體在生理狀態下，有少量的Nrf2和HO－1蛋白的表達，并處于轉錄翻譯與降解的平衡狀態，這樣就維持了生理條件下機體內的氧化／抗氧化系統的平衡。由于本研究只局限在蛋白水平，rhEPO對Nrf2、HO－1核酸水平的影響以及調控機制尚不明確。

有研究表明，PI3K［5］、PKC／絡氨酸［6］、MAPK［7］等細胞內信號傳導途徑在該抗氧化系統的激活機制中起了非常重要的作用。但有關rhEPO對該系統的激活機制的研究甚少，Hwang等［8］研究表明HO－1的上調是通過激活PI3K和ERK激酶而實現的。Gene等［2］的研究認為，rhEPO通過PI3K、MAPK途徑，促進Nrf2的核轉位，從而上調HO－1的表達。對于rhEPO激活該氧化系統的具體機制有待進一步研究。

rhEPO能在急性腦缺血大鼠模型中發揮神經保護作用，其機制可能與上調缺血半暗帶中Nrf2和HO－1的表達，參與Keap1－Nrf2／ARE抗氧化系統有關。

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