建立三叉神經(jīng)痛慢性縮窄環(huán)術(shù)大鼠模型的體會

張桂萍，曹曉嵐

三叉神經(jīng)痛是累及面部三叉神經(jīng)一支或幾支感覺分布區(qū)的反復(fù)發(fā)作的陣發(fā)性劇烈疼痛，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，為深入探討病因以及研究更好的治療方法，建立一種操作簡單、可重復(fù)利用的動物模型是非常必要的。以往的研究發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)的脫髓鞘病變是其主要病理基礎(chǔ)，眶下神經(jīng)（infraorbital nerve，ION）慢性縮窄環(huán)術(shù)（chronic constriction injury，CCI）三叉神經(jīng)痛模型，其致痛機(jī)制與目前比較公認(rèn)的脫髓鞘病變比較貼近，成功的模擬了三叉神經(jīng)痛。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)國外制作大鼠CCI－ION模型的先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)和國內(nèi)現(xiàn)有報(bào)道，建立了三叉神經(jīng)痛慢性縮窄環(huán)術(shù)大鼠模型，旨在探討中醫(yī)藥治療三叉神經(jīng)痛的有效性和安全性，為中醫(yī)藥治療三叉神經(jīng)痛提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和分組 成年雄性SD大鼠，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體質(zhì)量200g～250g，健康活潑者入選。共入選20只，根據(jù)隨機(jī)分組原則分為兩組，手術(shù)組：進(jìn)行右側(cè)眶下神經(jīng)的ION環(huán)扎術(shù)；對照組：進(jìn)行右側(cè)眶下神經(jīng)的ION假手術(shù)，即只分離眶下神經(jīng)而不進(jìn)行環(huán)扎。

1.2 動物模型的建立 參照丁麗華等［1］所提供的方法制成右側(cè)眶下神經(jīng)慢性縮窄環(huán)術(shù)三叉神經(jīng)痛模型。具體如下：10%水合氯醛（0.3mL／100g）大鼠腹腔內(nèi)注射，麻醉滿意后仰臥固定，于口腔內(nèi)右側(cè)齦頰邊緣平第一磨牙水平，向口鼻方向縱向切開約1cm長切口，暴露眶下神經(jīng)，分離周圍組織，用兩根4.0鉻腸線疏松結(jié)扎眶下神經(jīng)，兩線相距2mm。壓迫標(biāo)準(zhǔn)：肉眼可見結(jié)扎線使神經(jīng)的直徑略微變細(xì)，但不能完全阻斷其傳導(dǎo)，且神經(jīng)外膜的血液循環(huán)必須通暢。打結(jié)時(shí)可見大鼠面部微微抽動，術(shù)后4.0絲線縫合切口。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行，術(shù)前、術(shù)后無需應(yīng)用抗生素。

1.3 大鼠行為學(xué)檢測 結(jié)扎或暴露大鼠右側(cè)眶下神經(jīng)后，手術(shù)后每天對各組大鼠進(jìn)行機(jī)械刺激反應(yīng)閾值測試。在大鼠鼻區(qū)中央的觸須部位及周圍有毛皮膚（眶下神經(jīng)在面部的感覺支配區(qū)）手持刺激棒緩慢給予機(jī)械性刺激，機(jī)械刺激反應(yīng)閾值是由感覺測試器（von－frey－filament）來測定。纖絲使用強(qiáng)度是由細(xì)至粗，每一強(qiáng)度的細(xì)絲共刺激6次。動物的陽性反應(yīng)包括：①攻擊行為。大鼠可表現(xiàn)出快速抓咬刺激物，咬嚙或咀嚼動作，有時(shí)發(fā)出異常聲音。②回避反應(yīng)。經(jīng)刺激即表現(xiàn)為快速的后退動作，大鼠為避免面部進(jìn)一步被接觸，蜷縮身子向籠壁靠攏，或?qū)㈩^面部藏在身下，躲避刺激物。③非對稱性的面部搔抓，表現(xiàn)為至少連續(xù)3次搔抓面部刺激區(qū)域的動作，通常合并后退動作。出現(xiàn)以上3種反應(yīng)中任意1項(xiàng)或1項(xiàng)以上即認(rèn)為是刺激實(shí)驗(yàn)陽性，使大鼠產(chǎn)生陽性反應(yīng)細(xì)絲強(qiáng)度最小值即為疼痛反應(yīng)閾值。觀察兩組大鼠手術(shù)前后對于不同強(qiáng)度細(xì)絲刺激產(chǎn)生痛覺反應(yīng)閾值的變化。

2 結(jié) 果

對照組大鼠在刺激后無陽性反應(yīng)出現(xiàn)。手術(shù)組大鼠在結(jié)扎術(shù)后1d～8d，在大鼠術(shù)側(cè)面部觸須部位出現(xiàn)反復(fù)梳理毛發(fā)，撫摸、洗臉動作，而對刺激無躲避、搔抓面部、攻擊行為等陽性反應(yīng)出現(xiàn)；術(shù)后9d開始，大鼠出現(xiàn)包括躲避、攻擊、搔抓面部等反應(yīng)，但反應(yīng)程度較輕；隨時(shí)間推移，大鼠對刺激的反應(yīng)程度加重，至術(shù)后14d時(shí)反應(yīng)達(dá)高峰，表現(xiàn)為輕微刺激即誘發(fā)出強(qiáng)烈的行為反應(yīng)，出現(xiàn)頭的退縮反應(yīng)、回避行為及反復(fù)的摸臉動作。此反應(yīng)持續(xù)到術(shù)后28d。經(jīng)慢性縮窄術(shù)后的大鼠，與對照組大鼠相比，動作遲緩，體重增長減慢，在眶下神經(jīng)損傷區(qū)域出現(xiàn)感覺困擾，異常性疼痛。手術(shù)組術(shù)后9d、14d、21d、28d較術(shù)前3d及術(shù)后3d、6d痛閾值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 兩組術(shù)前、術(shù)后不同時(shí)間大鼠痛覺反應(yīng)閾值的變化

3 討 論

三叉神經(jīng)痛的發(fā)病機(jī)制仍不甚明了，確切的動物模型難以建立。目前已經(jīng)成功建立的模型所涉及的部位包括三叉神經(jīng)末梢、神經(jīng)干、神經(jīng)根、神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)核。鑒于對發(fā)病機(jī)制的闡述主要基于三叉神經(jīng)痛脫髓鞘改變的病理基礎(chǔ)［2］，ION－CCI模型是目前較常用的、較能表達(dá)其發(fā)病機(jī)制的模型方法。

3.1 實(shí)驗(yàn)動物的選擇 選用大鼠建立模型，是考慮大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)高度發(fā)達(dá)，遺傳基因最接近于人類，且對鎮(zhèn)痛藥物引起的行為學(xué)反應(yīng)最敏感和易觀察。大鼠性別選雄性SD大鼠，筆者曾用雌性SD大鼠做預(yù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其手術(shù)耐受性差，可能與大鼠性別或鼠齡過小有關(guān)，故統(tǒng)一選擇雄性大鼠。

3.2 手術(shù)入路的選擇 眶下神經(jīng)慢性縮窄環(huán)術(shù)模型，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道該模型手術(shù)暴露眶下神經(jīng)的入路有口內(nèi)［1］、顴骨下緣入路［3］和眉弓下法［4］，壓迫眶下神經(jīng)的不同部位。本文前述方法為經(jīng)口內(nèi)入路。顴骨下緣入路法：大鼠取俯臥位，頭部及四肢固定。沿大鼠左頰部顴骨下緣前1／3段（靠近鼻背部）做長約1cm切口，向觸須墊方向頓性分離皮下組織，顯露大鼠顴肌下緣。頓性分離肌肉周邊筋膜，暴露眶下孔，即可看到從眶下孔走出的眶下神經(jīng)。眉弓下法：大鼠取俯臥位，頭部及四肢固定。做眉弓上弧形切口，顯露顱骨額骨和鼻骨，暴露眼眶，沿眶上緣將眶內(nèi)容物用神經(jīng)剝離子撥開，暴露位于眶底部內(nèi)側(cè)的眶下神經(jīng)，在眶內(nèi)從近端仔細(xì)分離眶下神經(jīng)至遠(yuǎn)端的眶下孔。三種不同的入路，筆者預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)都做過，相比較經(jīng)口入路術(shù)式更簡單，眶下神經(jīng)更容易找到，出血較少，對實(shí)驗(yàn)動物的全身影響較小，故選擇此種手術(shù)方法。

3.3 結(jié)扎線的選擇 王維等［5］分別用鉻制腸線和絲線對大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)進(jìn)行松結(jié)扎，建立CCI模型，結(jié)果鉻制腸線制作CCI模型較之絲線制作CCI模型能引起更為明顯的痛閾降低。馬騁等［6］比較腸線、絲線、PE管三種材料制備大鼠神經(jīng)病理性疼痛CCI模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，均可造成滿意的CCI模型，但腸線造模的效果優(yōu)于后兩者。該模型導(dǎo)致輕度結(jié)扎的神經(jīng)水腫，進(jìn)而鉻腸線嵌壓于腫脹的神經(jīng)而形成慢性束縛性損傷導(dǎo)致部分神經(jīng)纖維的變性壞死。故本模型選用4－0鉻腸線結(jié)扎眶下神經(jīng)。

3.4 注意SD大鼠的麻醉用量 查閱文獻(xiàn)，好多文章建議用10%水合氯醛對大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射（0.4mL／kg）麻醉。筆者按照此推薦用量預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果致多只老鼠因麻醉過量死亡。后改為0.3mL／kg～0.35mL／kg后，都能取得滿意的麻醉效果且無一例死亡。當(dāng)然動物死亡也可能與其自身的狀態(tài)或所購藥物的濃度有關(guān)，但仍建議用10%水合氯醛0.3mL／kg～0.35mL／kg行腹腔內(nèi)注射即可，防止不必要的動物死亡發(fā)生。

3.5 造模后行為學(xué)改變的原因分析 術(shù)后1d～8d出現(xiàn)的對機(jī)械性刺激敏感下降可能與有髓鞘軸突變性、Aβ和Aδ纖維受影響、神經(jīng)沖動不能通過結(jié)扎處傳導(dǎo)有關(guān)。術(shù)后兩周出現(xiàn)的高反應(yīng)性可能和中樞突觸前或后的結(jié)構(gòu)、化學(xué)、物理改變有關(guān)。Vos等［7］觀察發(fā)現(xiàn)造模后動物的痛閾及行為學(xué)改變，約12周逐漸恢復(fù)?？紤]可能與腸線逐漸吸收、壓迫減輕以及神經(jīng)的再生恢復(fù)有關(guān)。

3.6 該模型的優(yōu)點(diǎn)及潛在不足 優(yōu)點(diǎn)是該模型的建立方法為慢性壓迫性損傷，從致病機(jī)制上與普遍公認(rèn)的血管壓迫學(xué)說類似，這樣就從致病機(jī)制和病理改變兩方面模擬了人類疾病。不足：CCI模型對神經(jīng)產(chǎn)生的創(chuàng)傷較大；并且由于模型制備過程中缺少量化標(biāo)準(zhǔn)，在不同的操作者手中產(chǎn)生的神經(jīng)損傷程度可能不同，不同個(gè)體對結(jié)扎線的反應(yīng)程度也可能不同，這直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。另外鉻線也可能對神經(jīng)有毒性，這些都有待進(jìn)一步改善。

［1］ 丁麗華，于生元.實(shí)驗(yàn)性三叉神經(jīng)痛慢性縮窄環(huán)術(shù)動物模型建立［J］.中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2004，10（1）：15－18.

［2］ Love S，Coakham HB.Trigeminal neural giapathology and athogenesis［J］.Brain，2001，124（12）：2349－2355.

［3］ 李娜，李超，樊娟，等.眶下神經(jīng)結(jié)扎后三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元鉀電流改變［J］.生理學(xué)報(bào)，2009，61（1）：72－78.

［4］ 周殯，劉玉光，吳承遠(yuǎn).建立三叉神經(jīng)痛動物模型［J］.山東醫(yī)藥，2005，45（3）：21－22.

［5］ 王維，馮澤國，馬濤，等.鉻制腸線與絲線制作CCI模型效果比較［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31（5）：480－482.

［6］ 馬騁，李翠賢，易建良，等.不同材料制備大鼠神經(jīng)病理性疼痛CCI模型的比較［J］.中國藥理學(xué)報(bào)，2008，24（4）：555－557.

［7］ Vos BP，Strassman AM，Maciewicz RJ.Behavioral evidence of trigeminal neuropathic pain following chronic constriction injury to the rat’s infraorbital nerve［J］.J Neurosci，1994，14（5）：27082－27231.