HIF－1α及其抑制劑對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷時神經細胞凋亡的影響

閆煥利，陰懷清，杜 洪，范澤衛

缺氧／缺血性腦損傷（hypoxia－ischemia brain damage，HIBD）是新生兒時期最常見且嚴重的神經系統損傷，其發病機制至今不明，目前缺乏有效的治療方法。缺氧誘導因子－1α（HIF－1α）是被低氧激活的核轉錄因子，可以通過調節其靶基因的表達促進或者抑制細胞凋亡［1，2］。有研究顯示，抑制HIF－1α的表達在腦缺血后的成年動物模型中產生神經保護作用［3，4］，但是HIF－1α及其抑制物在新生動物模型中的作用目前國內外報道甚少，本實驗應用HIF－1α的抑制劑2－甲氧基雌二醇（2ME2）作用于新生大鼠缺氧缺血模型，以期為新生兒缺氧缺血性腦損傷的發病機制闡明和治療提供新思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 一抗（兔抗鼠 HIF－1α、Bax、Bcl－2）和二抗（即用型SABC試劑盒）及TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒均購自武漢博士德生物技術有限公司。2ME2系美國Cayman公司提供，由于2ME2是脂溶性粉末物質，本實驗采用二甲基亞砜（DMSO）溶解后，用PBS稀釋使有毒物質DMSO的濃度降為5%，制成2ME2溶液。

1.2 動物分組及模型制備 120只清潔級、封閉群、新生7d齡Wistar大鼠，體重11g～15g，雌雄不限，購自山西醫科大學生理實驗室動物房。隨機分成假手術組（Sham組，n＝8）、缺氧缺血模型組（HIBD組，n＝56）、2ME2干預組（2ME2組，n＝56）。后兩組根據處死時間不同又分為7個亞組：3h、6h、12h、24h、48h、72h、7d，每亞組各8只。Sham組給予麻醉后切開頸部皮膚，游離左側頸總動脈后縫合皮膚；HIBD組給予麻醉后切開頸部皮膚，結扎左側頸總動脈，縫合皮膚后休息90min，置于缺氧倉中（含8%氧氣）2h。2ME2組同HIBD組制作HIBD模型，各亞組在缺血缺氧后10min給予一次性腹腔注射2ME2溶液（其中2ME2的含量為15mg／kg）。Sham組、HIBD組僅給予等量的DMSO＋PBS。

1.3 標本的制備 各組分別在模型制備后3h、6h、12h、24h、48h、72h和7d處死各組動物，斷頭取左側腦組織，10%多聚甲醛室溫固定24h，切塊，石蠟包埋后，連續做冠狀切片。

1.4 HE染色 常規石蠟切片→二甲苯脫蠟→梯度酒精脫水→蘇木素、伊紅染色→二甲苯透明→中性樹膠封片→顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組化

1.8 統計學處理 應用SPSS 13.0統計學軟件，數據以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK－q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 組織病理學觀察（HE染色） Sham組各時間點腦組織結構層次清晰，細胞排列整齊、形態正常，核仁清楚。HIBD組神經細胞水腫、壞死，胞體溶解，胞漿淡染，核固縮、碎裂、溶解及膠質細胞增生明顯。2ME2組各時間點腦組織病理變化較HIBD組明顯減輕，細胞排列尚規則，可見斑點狀神經元變性、壞死。

2.2 各指標的表達情況（免疫組化）

2.2.1 HIF－1α的免疫組化染色 光鏡下觀察：HIF－1α陽性染色呈棕黃色的細顆粒沉積，陽性細胞表達主要見于大腦皮層和海馬，陽性著色在細胞核和細胞質均可見。陰性對照切片中HIF－1α的免疫反應產物較其他兩組明顯減少。HIF－1α在Sham組表達微弱；在HIBD組于HIBD后3h增強，12h達高峰，之后下降，至7d時表達最低，但仍高于Sham組（P＜

1.5.1 HIF－1α的檢測 切片常規脫蠟至蒸餾水，至3%H2O2，室溫孵育15min，枸櫞酸緩沖液高壓熱修復2min，降溫至室溫，PBS液洗，加 HIF－1α的一抗（1∶150），濕盒置于4℃冰箱內過夜，復溫至室溫，PBS液洗，加二抗，濕盒置于37℃恒溫箱內孵育15min，PBS液洗，DAB顯色劑顯色，自來水中終止，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。陰性對照切片用PBS液代替一抗，余步驟相同。

1.5.2 Bax、Bcl－2的檢測 用Bax、Bcl－2的一抗代替 HIF－1α的一抗，稀釋濃度熱修復時間及余步驟與HIF－1α的檢測相同。

1.6 TUNEL計數細胞凋亡 嚴格按照試劑盒提供的實驗步驟操作。

1.7 圖像分析 采用BI－2000醫學圖像分析系統（成都泰盟科技有限公司）進行圖像采集與分析，在相同光亮強度和放大倍數（10×40）條件下統計陽性細胞平均灰度值（無單位），平均灰度值越高，陽性表達越弱，而平均灰度值越低，陽性表達越強。每只鼠3張片子，每張片子取4個視野，求其均數進行比較和分析。TUNEL計數：高倍鏡下（×400）在缺血側皮質區隨機選取10個非重疊視野，計數500個細胞，計算陽性率即凋亡指數（AI）＝陽性細胞數／觀察細胞數×100%。0.05）；2ME2組的表達趨勢和 HIBD組相同，但表達水平降低 （P＜0.05）。詳見表1。

表1 HIF－1α在新生鼠腦組織中的表達（x±s） 平均灰度值

2.2.2 Bax的表達 光鏡下觀察：Bax陽性染色呈棕黃色的細顆粒沉積，陽性細胞表達主要見于大腦皮層和海馬，陽性著色主要位于神經元胞漿。陰性對照切片中免疫反應產物明顯減少。Bax在Sham組各時間點低水平表達；在HIBD組，于HIBD后3h即明顯增強，至24h達高峰，之后降低，但始終高于Sham組（P＜0.05）；2ME2組各時間點Bax的表達趨勢先降低后升高，2 4h表達最低，各時間點表達水平較HIBD組明顯降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 Bax在新生鼠腦組織中的表達（x±s） 平均灰度值

2.2.3 Bcl－2的表達 Bcl－2陽性染色呈棕黃色的細顆粒沉積，陽性細胞表達主要見于大腦皮層和海馬，陽性著色主要位于神經元胞漿。陰性對照切片中免疫反應產物明顯減少。Bcl－2在Sham組各時間點呈低水平表達；在HIBD組于HIBD后3h增強，至2 4h達高峰，之后降低，但始終高于Sham組（P＜0.05）；2ME2組各時間點的表達趨勢同HIBD組，表達量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表3。

表3 Bcl－2在新生鼠腦組織中的表達（x±s） 平均灰度值

2.2.4 Bax／Bcl－2灰度值的比值 Sham 組為1.08±0.54；HIBD組3h、6h、1 2h、2 4h、4 8h、7 2h、7d各亞組為0.8 3±0 .07、0.82±0.07、0.82±0.05、0.85±0.09、0.89±0.06、0.91±0.06、0.98±0.07；2ME2組各亞組的比值為0.96±0.08、1.07±0.13、1.27±0.14、1.68±0.14、1.27±0.17、1.27±0.14、1.23±0.25。與Sham組比較，HIBD組各個時間點的Bax／Bcl－2平均灰度值比值均低，即表達量比值高，即腦組織的損傷較Sham組重。2ME2組各時間點的Bax／Bcl－2平均灰度值比值較HIBD組均高，即表達量比值較低，提示腦組織的損傷較HIBD組減輕。與Sham組比較，12h之前，2ME2組平均灰度值比值較低，而之后較高，表明12h之內仍表現為對腦組織的損傷作用，12h之后則表現為保護作用。

2.3 腦細胞凋亡情況 TUNEL陽性細胞呈深褐色，主要見于大腦皮層和海馬區。HIBD組的腦細胞凋亡最多，2ME2組較之明顯減少，Sham組凋亡細胞少見。詳見表4。

表4 Tunnel法計數腦細胞凋亡（x±s）%

3 討 論

HIF－1對維持機體的氧平衡有重要作用，由HIF－1α和HIF－1β兩個亞基組成，其中HIF－1α亞基在缺氧誘導的細胞凋亡中起關鍵作用［5］。本實驗結果顯示，HIF－1α的表達在缺氧缺血先升高后降低，考慮與復氧后泛素系統的活性恢復、HIF－1α降解增加有關。有關HIF－1α在缺氧缺血性腦損傷中究竟是促進還是抑制細胞凋亡，目前尚存在爭議。

Bax在未成熟腦中呈高表達，Bax依賴性的細胞凋亡機制在未成熟腦中占明顯優勢［6］。Bcl－2家族蛋白在細胞凋亡的調節中發揮關鍵作用［7］。本實驗選用的指標Bax和Bcl－2分別是Bcl－2家族蛋白中促凋亡和抗凋亡的重要成員，參與Bax依賴性的細胞凋亡機制。

2ME2是雌激素的正常代謝產物，存在于人體的血液與尿液中，是一種有效的缺氧誘導因子－1α阻滯劑，且專一的影響H IF－1α亞基，并沒有影響HIF－1β或其他轉錄因子［8］。本研究結果顯示，應用2ME2抑制HIF－1α后，HIF－1α在 HIBD后的表達明顯降低，促進凋亡的蛋白Bax的表達明顯降低，抑制凋亡的蛋白Bcl－2的表達明顯升高，引起Bax／Bcl－2表達量比值降低，最終腦細胞凋亡明顯減少，腦損傷減輕，表明HIF－1α的過度表達對缺氧缺血性腦損傷是有害的，這與 Helton等［9］和Chang等［4］的結果是一致的。Helton和Chang等分別通過特異性的敲除腦組織的HIF－1α基因和使用川芎嗪抑制HIF－1α后發現缺氧缺血性腦損傷減輕。另外Calvert等［10］指出高壓氧和正常氧治療后，HIF－1α的表達較非治療組均降低，而腦損傷減輕，也可以從一個側面反映HIF－1α的過度表達對HIBD是有害的。

然而也有報告如Baranova等［11］認為神經元特異性的失活HIF－1α會增加短暫局灶性腦缺血損傷，HIF－1α整體上來說介導的是一個有益的反應。有意義的是Baranova等［11］研究證實，對野生型小鼠MCAO（大腦中動脈缺血）6h～12h后缺氧缺血區的促凋亡基因BNIP3和NIX在mRNA和蛋白水平均上升，在缺氧缺血急性期（＜12h）HIF－1α促進細胞凋亡。這和本研究的結果是相同的。因此，推測2ME2發揮神經保護作用的機制是它在缺氧缺血早期抑制HIF－1α表達從而減少此時的促凋亡基因的表達。然而，2ME2的其他性質已報告，如抗新血管生成和改變炎癥反應等，這些性質本身也可以減輕缺氧缺血性腦損傷。本實驗尚不能肯定2ME2的神經保護作用是通過抑制HIF－1α表達產生的，尚待進一步的研究證實。

另有報告，如Sheldon等［12］采用Cre／Lox技術使前腦主要的神經元特異性的失活HIF－1α，認為HIF－1α缺失會增加新生兒缺氧缺血性腦損傷。但是這個模型中小鼠在缺氧環境中僅僅暴露30min，產生的是中度的腦損傷，這與本實驗缺氧程度、動物種類及模型制備等是不同的。目前有研究指出，HIF－1α在缺氧缺血性腦損傷中發揮促進和抑制凋亡的雙重作用，可能由于缺氧缺血持續的時間［13］及程度不同引起所調節的靶基因不同產生的。輕、中度缺氧時，HIF－1α的復合物穩定，引起VEGF、EPO等具有神經保護作用的靶基因表達［14］。但在嚴重或持續缺氧時，HIF－1α使細胞內的p53、BNIP3等水平增高，導致神經毒性［15］。另外，HIF－1α究竟是發揮哪種作用，還依賴于病理刺激的類型［16］及涉及反應的細胞類型［17］等。

綜上所述，HIF－1α在缺氧缺血性腦損傷究竟是發揮促進還是抑制腦細胞凋亡的作用，和眾多因素有關。本研究表明缺氧缺血后HIF－1α的過度表達對HIBD是有害的。2ME2通過降低急性期HIF－1α的表達，使促凋亡蛋白Bax的表達降低，抑凋亡蛋白Bcl－2的表達升高，Bax／Bcl－2表達量比值降低，改善腦損傷。HIF－1α的抑制劑給新生兒缺氧缺血性腦損傷的治療帶來新的希望。

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