拉莫三嗪和乙琥胺對(duì)顳葉癲癇的神經(jīng)可塑性實(shí)驗(yàn)研究1）

王 瓊，孫美珍，陳彥軍

顳葉癲癇為成年難治性癲癇的主要類型，氯化鋰－匹羅卡品誘導(dǎo)的顳葉癲癇模型成功的復(fù)制了人類復(fù)雜部分性發(fā)作，通過(guò)注射匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）形成，15d后大鼠出現(xiàn)自發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作（spontaneous recurrent epileptic seizure，SRS）現(xiàn)象，這是一個(gè)成熟的慢性癲癇模型［1］。拉莫三嗪（lamotrigine，LTG）現(xiàn)已廣泛用于難治性癲癇的治療，但在此模型上的實(shí)驗(yàn)研究目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。乙琥胺（ethosuximide，ESX）是失神性癲癇的首選用藥，Leite等［2］在此模型上使用ESX，發(fā)現(xiàn)ESX不能減少慢性期大鼠自發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作的次數(shù)，但并沒(méi)有進(jìn)一步觀察腦電圖和病理學(xué)變化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)行為學(xué)、腦電圖、病理學(xué)等方面來(lái)評(píng)價(jià)LTG和ESX對(duì)該模型的作用，進(jìn)一步為L(zhǎng)TG的臨床治療提供理論依據(jù)，并探索ESX對(duì)此模型的腦電影響和神經(jīng)可塑性改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雌性SD大鼠50只，體重180g～220g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水，自然光照射，換氣扇通風(fēng)。

1.2 慢性癲癇模型制備 成年雌性SD大鼠，氯化鋰3mmol／kg腹腔注射，18h～24h后首劑腹腔注射匹羅卡品30mg／kg，30 min后如無(wú)Ⅳ級(jí)以上發(fā)作，可每隔15min注射10mg／kg追加劑量，直至出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上無(wú)明顯間歇的SE。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物癇性發(fā)作分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)采用Racine（1972年）分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［3］選取發(fā)作級(jí)別為Ⅳ級(jí)或Ⅳ級(jí)以上者，SE持續(xù)60min后注射地西泮10mg／kg終止發(fā)作，終止發(fā)作后存活者視為造模成功。造模后大鼠于15 d后會(huì)出現(xiàn)自發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作（spontaneous recurrent epileptic seizure，SRS）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)分為模型組、正常對(duì)照組、LTG低劑量組、LTG高劑量組、ESX低劑量組、ESX高劑量組6組。模型組：使用氯化鋰－匹羅卡品按上述方法進(jìn)行造模，造模后無(wú)藥物干預(yù)；正常對(duì)照組：以相同體積的0.9%氯化鈉取代氯化鋰、匹羅卡品、地西泮腹腔注射，無(wú)藥物干預(yù)；LTG低劑量組：造模后24h以內(nèi)給予拉莫三嗪10mg／kg灌胃，每天2次，連續(xù)7d給藥；LTG高劑量組：造模后24h以內(nèi)給予拉莫三嗪20mg／kg，每天2次；ESX低劑量組：造模后24h以內(nèi)給予乙琥胺25mg／kg腹腔注射，每天2次，連續(xù)7d給藥；ESX高劑量組：造模后24h以內(nèi)給予乙琥胺50mg／kg，每天2次。

1.4 方法

1.4.1 行為學(xué)觀察 采用視屏監(jiān)測(cè)大鼠24h活動(dòng)，記錄大鼠出現(xiàn)SRS后4周的癲癇發(fā)作情況（發(fā)作強(qiáng)度和發(fā)作次數(shù)）。

1.4.2 腦電圖采集 分別記錄致癇后30d的腦電圖，將大鼠用25%烏拉坦麻醉，使其處于半清醒狀態(tài)，固定于腦立體定位儀上，定位在海馬（矢狀縫旁2mm，冠狀縫后4mm，骨膜下5 mm），用BL－420F型電生理信號(hào)采集儀描記腦電活動(dòng)。記錄尖波，棘波，尖、棘慢復(fù)合波等癇性波的頻率及波幅。

1.4.3 Timm組織化學(xué)染色 SE后30d，10%水合氯醛麻醉大鼠，經(jīng)左心室分別迅速灌注生理鹽水100mL、0.4%硫化鈉緩沖液150mL、4%多聚甲醛400mL，之后斷頭取腦，以4%多聚甲醛固定4h～6h，30%蔗糖4℃浸泡過(guò)夜，行恒溫冷凍冠狀切片，切片厚度30μm，貼附于載玻片上。每只大鼠隔5張腦片取一張組成一套，每套切片8張～10張，共8套片子。行Timm組織化學(xué)染色方法。暗室中將切片浸入新鮮配制Timm孵育液［50%阿拉伯膠60mL、枸櫞酸緩沖液（25.5%檸檬酸＋23.5%枸椽酸鈉］10mL、5.7%對(duì)苯二酚溶液30mL和17%硝酸銀2 mL），置于室溫下避光染色45min～60min，蒸餾水洗凈，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，置光學(xué)顯微鏡下觀察。光鏡下行齒狀回內(nèi)分子層timm銀染苔蘚纖維發(fā)芽MFS評(píng)分［4］。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)0分：未見(jiàn)出芽；1分：偶可見(jiàn)點(diǎn)狀出芽；2分：可見(jiàn)點(diǎn)狀或稀疏狀出芽；3分：可見(jiàn)片狀出芽；4分：可見(jiàn)高濃度的片狀出芽；5分：可見(jiàn)連續(xù)致密濃度片狀出芽。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD組間比較。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)觀察 注射匹羅卡品后大鼠均于5min內(nèi)出現(xiàn)外周膽堿能反應(yīng)（M樣作用），如瞳孔縮小、豎毛、血淚、流涎、腹瀉。5min～15min后出現(xiàn)Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)發(fā)作。17min～37min后出現(xiàn)SE的大鼠均發(fā)展為Ⅳ級(jí)、Ⅴ級(jí)連續(xù)發(fā)作。50只大鼠，4只為正常對(duì)照組，其余均造模，誘發(fā)SE并達(dá)Ⅳ級(jí)及以上的40只，造模成功率為87%。存活鼠進(jìn)入2d～4d的毒性階段，表現(xiàn)為蜷伏不動(dòng)，不思飲食，極易激惹。此后行為漸趨正常。經(jīng)過(guò)靜默期后（SE后15d），可觀察大鼠出現(xiàn)Ⅰ級(jí)～Ⅴ級(jí)自發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作，最初多為局部性發(fā)作如前肢陣攣或面部抽搐，很快發(fā)展至全身強(qiáng)直性驚厥發(fā)作，一般持續(xù)時(shí)間不超過(guò)1min，發(fā)作均可自行終止。統(tǒng)計(jì)自SRS出現(xiàn)后1個(gè)月的發(fā)作次數(shù)（見(jiàn)表1）。正常對(duì)照組大鼠無(wú)驚厥發(fā)作，匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠SE后，慢性期均可見(jiàn)大鼠有不同程度的驚厥發(fā)作，而經(jīng)過(guò)拉莫三嗪的干預(yù)后，低、高劑量組均不同程度的抑制了癲癇的發(fā)作次數(shù)，并且以高劑量組更為明顯。乙琥胺用藥后，與模型組大鼠比較，25%的大鼠較明顯地減少自發(fā)性癲癇的發(fā)作次數(shù)，38%的大鼠發(fā)作次數(shù)減少不明顯，31%的大鼠發(fā)作次數(shù)明顯增加。通過(guò)統(tǒng)計(jì)，ESX各組與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且高、低劑量組間也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠每周每只大鼠SRS平均發(fā)作次數(shù)（x±s）

2.2 腦電圖觀察 正常對(duì)照組大鼠EEG以5Hz～10Hz的低波幅α、β波為主，波幅以50μV～100μV為主。慢性期模型組大鼠EEG表現(xiàn)為背景節(jié)律增快，陣發(fā)性尖棘波、多棘波、多尖波發(fā)放，波幅均大于200μV；LTG低、高劑量干預(yù)后腦電圖均有改善，節(jié)律減慢，棘波、尖波減少，波幅降低，且以高劑量組改善明顯；ETX低、高劑量干預(yù)組和模型組腦電圖無(wú)明顯差別，仍節(jié)律性出現(xiàn)尖波、棘波，頻率快，波幅高。

2.3 苔蘚纖維發(fā)芽（見(jiàn)表2） 海馬齒狀回顆粒細(xì)胞苔蘚纖維終末富含Zn＋，硫化銀對(duì)Zn＋特異性染色呈棕黃或黑色顆粒。正常對(duì)照組大鼠齒狀回及CA3區(qū)齒狀顆粒細(xì)胞軸突分布區(qū)有密集濃染的黑色顆粒，極少見(jiàn)到有苔蘚纖維穿越齒狀回顆粒細(xì)胞層到齒狀回內(nèi)分子層及CA3區(qū)椎體細(xì)胞始層；模型組可觀察到有較多的苔蘚纖維穿過(guò)顆粒細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)分子層和CA3區(qū)，表現(xiàn)為片狀出芽；LTG低、高劑量組Timm染色可見(jiàn)點(diǎn)狀或稀疏狀出芽；ESX低、高劑量組齒狀回和CA3區(qū)同樣可見(jiàn)片狀出芽。通過(guò)對(duì)各組大鼠齒狀回和CA3區(qū)MFS評(píng)分統(tǒng)計(jì)得出：LTG高、低劑量組與模型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LTG低、高劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LTG各組均可抑制齒狀回和CA3區(qū)苔蘚纖維發(fā)芽，且以高劑量組效果顯著；ESX高、低劑量組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ESX低、高劑量組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ESX各組不能抑制苔蘚纖維向齒狀回和CA3區(qū)發(fā)芽。

表2 各組大鼠MFS染色評(píng)分（x±s） 分

3 討 論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得出，LTG可以抑制慢性期自發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作，改善腦電圖的表現(xiàn)。Jari Nissinen［5］在杏仁核點(diǎn)燃誘發(fā)的顳葉癲癇的研究中發(fā)現(xiàn)，LTG可以減少84%的自發(fā)性癲癇，發(fā)作次數(shù)減少多于50%的占88%。但在匹羅卡品誘導(dǎo)的顳葉癲癇上，目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)LTG低、高劑量組均能減少慢性期自發(fā)性癲癇的反復(fù)發(fā)作，可以抑制癲癇的發(fā)生，尤以高劑量組效果顯著。LTG可以有效地改善慢性期癲癇大鼠的腦電圖，減少癇性波的頻率，降低癇性波的波幅，與行為學(xué)觀察結(jié)果一致。LTG的抗癲癇機(jī)制包括抑制電壓依賴性鈉通道，穩(wěn)定細(xì)胞膜防止異常放電，抑制突觸前膜谷氨酸鹽釋放等［6］。在此模型中Remy等［7］研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，LTG可以阻斷64%鈉離子通道開(kāi)放，從而抑制異常放電，減少癇性發(fā)作。Leite等［2］在此模型上使用ESX，發(fā)現(xiàn)ESX不能減少慢性期大鼠自發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作的次數(shù)，對(duì)此模型無(wú)效，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論與上述一致。Jari等［5］刺激杏仁核誘發(fā)顳葉癲癇的模型里，ESX減少大鼠自發(fā)性癲癇大于50%的占38%，剩余的大鼠發(fā)作次數(shù)減少不明顯或增加發(fā)作次數(shù)，這與本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果相似。ESX干預(yù)后慢性期腦電圖與無(wú)藥物干預(yù)的癲癇大鼠相比無(wú)明顯改善，同樣符合行為學(xué)觀察結(jié)果。ESX的藥理作用與抑制T型Ca2＋通道有關(guān)，ESX可以抑制丘腦細(xì)胞低閾值T型Ca2＋電流，從而阻斷丘腦3Hz／s的異常放電，而丘腦神經(jīng)元T型Ca2＋電流是形成失神發(fā)作3Hz／s的棘慢復(fù)合波的基礎(chǔ)結(jié)合本實(shí)驗(yàn)與以往的研究發(fā)現(xiàn)ESX對(duì)顳葉癲癇的發(fā)生無(wú)預(yù)防作用，推測(cè)ESX可能對(duì)顳葉的異常放電不起作用。

業(yè)已證實(shí)，海馬損傷是癲癇發(fā)生的結(jié)果，又是顳葉癲癇形成的原因。苔蘚纖維發(fā)芽（mossy fiber sprouting，MFS）是一種常見(jiàn)的顳葉海馬損傷的表現(xiàn)，MFS是一種神經(jīng)再生現(xiàn)象，即海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的軸突在齒狀回內(nèi)分子層，CA3區(qū)下椎體層的異常生長(zhǎng)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是由門區(qū)及CA3區(qū)的神經(jīng)元死亡所誘發(fā)的，神經(jīng)元的興奮性遞質(zhì)的釋放、凋亡以及缺失可以誘發(fā)MFS和突觸重構(gòu)［8］。苔蘚纖維為興奮性氨基酸能神經(jīng)纖維，MFS將抑制性環(huán)路變成興奮性環(huán)路，增加了發(fā)作敏感性從而促進(jìn)癲癇的形成，成為SRS的主要原因［9］。李國(guó)良等［10］發(fā)現(xiàn)匹羅卡品模型慢性期MFS隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，出芽越顯著，SE后30d最顯著，以后出芽緩慢，SE后60d與30d相比無(wú)明顯變化。本實(shí)驗(yàn)觀察SE后30d的MFS變化，發(fā)現(xiàn)與模型組比較LTG低、高劑量組均能抑制苔蘚纖維向門區(qū)及CA3區(qū)椎體細(xì)胞延伸，高劑量組作用顯著。LTG抑制MFS機(jī)制尚不明確，在Smolders等［11］的電刺激誘發(fā)SE的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)微注射LTG的方法，觀察發(fā)現(xiàn)LTG能影響海馬中谷氨酸、GABA以及多巴胺的含量，從而減少慢性期SRS次數(shù)和抑制MFS，其干預(yù)機(jī)制較為復(fù)雜，推測(cè)可能與興奮性與抑制性環(huán)路有關(guān)，并未明確。以往的實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有ESX在病理學(xué)方面的進(jìn)一步研究，通過(guò)我們的研究發(fā)現(xiàn)，ESX不能抑制苔蘚纖維向齒狀回和CA3區(qū)出芽。我們的實(shí)驗(yàn)從病理學(xué)的方面支持行為學(xué)和腦電圖的表現(xiàn)，為以往的觀點(diǎn)提供了更多的證據(jù)。

下一步我們的研究要從各期興奮性與抑制性氨基酸遞質(zhì)水平變化與神經(jīng)可塑性的關(guān)系著手，揭示LTG對(duì)各期每種遞質(zhì)的影響以及遞質(zhì)變化和MFS之間的關(guān)系。

［1］ Kreak P，Mikudecka A，Druge R，et al.An animal model of nonconvulsive status epilepticus：A contribution clinicacontroversies［J］.Epilepsia，2001，42（2）：171－180.

［2］ Leite JP，Cavalheiro EA.Effects of conventional antiepileptic drugs in a model of spontaneous recurrent seizures in rats［J］.Epilepsy Research，1995，20：93－104.

［3］ Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation：Motor seizure［J］.Electroencophaogar Clin Neurophysial，1972，32：781－794.

［4］ Wuarin JP，Dudek FE.Excitatory synaptic input to granule cells increase with time after kainite treatment［J］.J Neurophysiol，2001，85：1067－1077.

［5］ Jari Nissinena，Asla Pitk.Effect of antiepileptic drugs on spontaneous seizures in epileptic rats［J］.Epilepsy Research，2007，73：181－191.

［6］ Tomas RB，Gregory LH.Handbook of Epilepsy［M］.劉獻(xiàn)增，王曉飛，譯.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：203－251

［7］ Remy S，Urban BW，Elger CE，et al.Anticonvulsant pharmacology of voltage－gated Na－channels in hippocampal neurons of control and chronically epileptic rats［J］.J Neurosci，2003，17（12）：2648－2658.

［8］ Schauwecker PE，Ramirez JJ，Steward O.Genetic dissection of the signals that induces synaptic reorganization［J］.Exp Neurol，2000，161：139－152.

［9］ Lobo MK，Cepeda C.Innotrpic glutamate receptor expression an dopam inergic modulation in the developing suthalamic nucleus of the tat an immunohistochemical and electrophysiological analysis［J］.Neuroscience，2003，25（6）：384－393.

［10］ 李國(guó)良，張寧，李靜，等.匹羅卡品誘導(dǎo)顳葉癲癇大鼠齒狀回苔蘚纖維出芽及突觸重建［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2004，29（4）：424－428.

［11］ SmoldersL，Khan GM，Mani L，et al.NMDA receptor－mediated pilocarpine－induced seizure：Characterization in freely moving rats by microdialysis［J］.Br J Pharmacol，1997，121（6）：1171－1179.