4株何首烏根部土壤真菌產纖維素酶活性的研究

馬雅鴿 趙榮華 趙聲蘭

云南中醫學院，云南 昆明 650000

何首烏作為珍貴藥用植物始載于《開寶本草》，為寥科植物何首烏Polygonum multiflorum thumb．的干燥塊根。近年來已有大量科學研究證明，何首烏中結合型蒽醌衍生物能刺激腸道引起腸道充血性炎癥，導致惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等不良反應［1］。而結合型蒽醌衍生物大多是以糖苷鍵結合的化合物［1，2］，纖維素酶有水解糖苷鍵的作用［3］。本課題組從何首烏根部土壤篩選真菌，對何首烏進行固體發酵，找到了4株對結合型蒽醌類分解能力較強的真菌菌株。因此，本文對這4株真菌產生的纖維素酶進行研究。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 YZ3.66、YZ3.57、YZ3.23、YZ3.41從云南中醫學院關上校區種植何首烏的根部土壤及祿勸縣種植何首烏的根部土壤分離獲得。

1.2 DNS法測定纖維素酶活力

1.2.1 高產纖維素酶菌株發酵液的制備［3］選取菌株制備孢子懸液:純化的真菌菌株在PDA斜面培養基上活化7d后，在斜面培養菌種試管中加入0．9%無菌氯化鈉溶液3～5m l，再將少許滅菌棉花塞進試管，用吸管將其推進試管，借助棉花將孢子推入試管下部，然后將孢子液吸出，制成孢子懸浮液，在光學顯微鏡下用紅血球計數板計數，得到終濃度為1×106CFU/ml的孢子懸液，取100μl接種于滅菌的150m l液體PDF培養基，28℃、110r/min振蕩培養液體發酵，24h后每間隔12h吸取發酵液測定不同培養時間下酶活力，直至168h后檢測完畢。

1.2.2 葡萄糖標準曲線的繪制［3、4］準確稱量1.0000g去水恒重的葡萄糖，用適量蒸餾水溶解轉移至500m l容量瓶定容，得濃度為2mg/ml的葡萄糖標準溶液，置于4℃保存。取25ml刻度試管并編號，按表1順序加入葡萄糖標準液、水及DNS試劑，上述試劑混勻后，在沸水浴中準確反應5min進行顯色，然后以冷流水迅速冷卻，蒸餾水定容至25 m l，搖勻。以空白調零在UV－4802H型紫外可見分光光度計測定各反應體系在540nm處的吸光值。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標，吸光值OD540為縱坐標，繪制標準曲線，求得該曲線的回歸方程。

表1 葡萄糖標準溶液配方

1.2.3 樣品纖維素酶活力的測定［5］取25ml刻度試管置于50℃的恒溫水浴中。吸取一定稀釋度的酶溶液0.5ml加入試管中，然后再分別加入已經預熱到50℃的0.5m l檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液和0.5ml2%的CMC溶液。另取一支25ml刻度試管，在其中加一定稀釋度的酶溶液0.5ml，經沸水浴滅活，再加0.5m l2%CMC溶液和0.5m l緩沖液作空白。將兩試管一起50℃恒溫30min后，沸水終止反應，搖勻吸取上清液0.5m l放入試管中，在各試管中分別加入3mlDNS。然后，將兩試管同時置于沸水浴中顯色5min，冷卻至室溫，分別用蒸餾水定容至25m l，搖勻。反復振蕩試管，靜置約20min，取每個試管中的上清液在540nm波長下測定吸光度A值。

反應生成的葡萄糖的量根據葡萄糖標準曲線求得。纖維素酶活力的按照下式計算:

一個CMC酶活力單位定義為每分鐘生成1μmol葡萄糖所需的酶量，單位:IU/m l。

1.2.4 方法學考察［6］(1)精密度試驗 精密度是指用特定的分析程序在受控條件下重復分析同一樣品所得測定值的一致程度，它反映分析方法或測量系統所存在隨機誤差的大小。極差、平均偏差、相對平均偏差、標準偏差和相對標準偏差都可用來表示精密度大小，較常用的是標準偏差或相對標準偏差。

4個菌株樣品分別取一定的量，進行纖維素酶活測定。將同一樣品連續測定六次，計算其葡萄糖含量的標準偏差(S)和相對標準偏差 (RSD/%)。

(2)樣品的加標回收率試驗 加標回收率即在樣品中加入標準物質，測定其回收率，以確定準確度，多次回收試驗還可發現方法的系統誤差，這是目前常用而方便的方法，其計算式是:回收率=(加標試樣測定值—試樣測定值)/加標量·100%

取一定量的樣品溶液，加入不同量的葡萄糖標準品溶液，測其吸光值，并計算葡萄糖濃度，然后計算標準品的回收率。

(3)樣品中纖維素酶含量的計算 根據重復測定時所得試驗值，4株真菌樣品中的纖維素酶的含量。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

2.2 精密度試驗結果 分別吸取培養120h的4個樣品稀釋后的溶液0.50ml，進行精密度試驗，結果如表2所示。

圖1 葡萄糖標準曲線圖

表2 樣品的精密度試驗結果

由表2可以看出，4個樣品的精密度試驗中，YZ3.66相對標準偏差為1.3912%，YZ3.57相對標準偏差為1.0891%，YZ3.23相對標準偏差為1.04%，YZ3.41相對標準偏差為2.4957。精密度試驗考察的是一組測量數據間的接近程度，數據之間的相對標準偏差越小，說明測量結果越精確。4個樣品的精密度數值都在在誤差允許范圍5%以內，所以說結果是可信的。

2.3 樣品的加標回收率試驗 (準確性試驗結果) 分別取培養168h的4株真菌稀釋溶液不同的量，然后加入不同體積的2mg/ml葡萄糖標準溶液，進行測定。試驗結果分別如表3、表4、表5、和表6所示。

由表3可以看出:YZ3.66樣品的標準品回收率平均值為100.3%，此次測定加標回收率在允許范圍 (95～105%)內，因此可證實此試驗結果的可靠性。

由表4可以看出:YZ3.57樣品的標準品回收率平均值為99.9%，此次測定加標回收率也在允許范圍 (95～105%)內，因此可證實此試驗結果的可靠性。

由表5可以看出:YZ3.23樣品的標準品回收率平均值為99.5%，此次測定加標回收率也在允許范圍 (95～105%)內，因此可證實此試驗結果的可靠性。

由表6可以看出:YZ3.41樣品的標準品回收率平均值為100.1%，此次測定加標回收率也在允許范圍 (95～105%)內，因此可證實此試驗結果的可靠性。

2.4 四株真菌纖維素酶活的測定結果與討論 四株真菌纖維素酶活的測定結果如表7所示。

表3 YZ3.66樣品的加標回收率試驗結果

表4 YZ3.57樣品的加標回收率試驗結果

表5 YZ3.23樣品的加標回收率試驗結果

表6 YZ3.41樣品的加標回收率試驗結果

表7 纖維素酶活力的測定結果

時間 (h) YZ3.66酶活 (IU/ml) YZ3.57酶活 (IU/ml) YZ3.23酶活 (IU/ml) YZ3.41酶活 (IU/ml)84 0.84 0.80 2.86 0.92 96 1.87 1.83 2.86 0.93 108 2.32 2.21 3.09 1.01 120 2.38 2.34 4.28 2.02 132 2.51 2.49 6.73 2.56 144 2.60 2.58 8.19 2.56 156 3.35 3.33 8.54 4.30 168 3.54 3.52 8.54 4.59

由表7可以看出:隨著培養時間的增加，這四個菌株的產酶能力都在增加，YZ3.66和YZ3.57產酶的增長速度近似，最終的產酶能力也近似;YZ3.23產酶速度平穩，并且速度最快;YZ3.41前期產酶速度最慢，中后期加快。在同一培養時間內YZ3.23菌株產纖維素酶活性最大，YZ3.41菌株次之，YZ3.66菌株和YZ3.57菌株產纖維素酶活性接近并且最小。培養7天后，這4株真菌產纖維素酶活性分別為:YZ3.23=8.54IU/ml，YZ3.41=4.59IU/m l，YZ3.66=3.54IU/ml，YZ3.57=3.52IU/ml。

3 結論

本論文采用 DNS法對 YZ3.66、YZ3.57、YZ3.23、YZ3.41四株真菌的產纖維素酶進行性測定，對此方法進行了精密度和準確性的方法學考察，發現此方法準確可靠。經過7天培養，連續測定纖維素酶活力，發現這四株真菌都有產纖維素酶的能力，在同一培養時間內YZ3.23菌株產纖維素酶活性最大，YZ3.41菌株次之，YZ3.66菌株和YZ3.57菌株產纖維素酶活性接近并且最小。培養7天后，這4株真菌產纖維素酶活性分別為:YZ3.23=8.54IU/ml，YZ3.41= 4.59IU/ml， YZ3.66=3.54IU/ml， YZ3.57=3.52IU/ml。

［1］李鐵建．不同蒸制時間制首烏對瀉下作用的影響［D］．延邊:延邊大學，2007，5－6．

［3］ Zhang Ning．The screening of the Chitinase and Cellulase creation fungi and investigation of the activity of both the enyzymes［D］．長春:Ji Ling University，2007，17－20．

［4］ Lu Jiahua．Cellulase Enzymatic Treatment on Ceulosic Fiber［D］．shanghai:Dong Huay University，2003，28 －29．

［5］ Zhu Junjun．Immobilization ofβ －glucosidase and its improvement in cellulose enzymatic hydrolysis［D］．Nanjing:Nanjing Forestry University，2006，17－18．

［6］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典2010版 (一部) ［M］．北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄130．