施用鈍化劑對鎘污染稻田土壤微生物學特征的影響

周 斌 ，黃道友 ，朱奇宏 ，饒中秀 ，劉守龍

（1.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南長沙410125；2.中國科學院研究生院，北京100049）

國家環保總局的調查結果顯示，我國鎘污染的農田面積已突破28萬hm2，年產鎘超標農產品達150萬t[1]。土壤鎘污染已成為我國的一個重要環境問題，嚴重威脅到了農產品的質量安全和農業區域生態系統的穩定。施用化學鈍化劑被認為是修復利用鎘污染土壤的一種經濟有效的途徑[2]。然而，鈍化劑的大量施用，不僅改變了土壤的基本理化性質，也可能對土壤的微生物種群與生態環境產生影響。因此，研究土壤微生物對鈍化劑儲備性施用的響應，既是對其鈍化修復技術效果評價的重要內容，也是對其進行生態風險評估不可或缺的內容。前人研究證實施用石灰[3-4]、鈣鎂磷肥[5-6]和海泡石[7]等鈍化劑，可以提高土壤的pH值，從而降低土壤中鎘的生物有效性[8]；有機鈍化劑[9]和海泡石[10]等則可通過吸附作用，從而減少土壤中的重金屬有效性。本課題組通過田間小區試驗研究發現，鎘污染稻田通過儲備性施用石灰、鈣鎂磷肥、海泡石和腐植酸礦粉等鈍化劑，能顯著降低土壤中的有效態鎘含量，減少水稻對鎘的吸收和積累[7]。土壤微生物和土壤酶不僅推動著土壤有機質的礦化分解與養分物質的循環與轉化，而且還是表征土壤質量的重要指標，能敏感地反映土壤環境的微小變化[11]。近年來，隨著分子生物學技術的迅猛發展，末端限制性酶切片段長度多態性分析（T-RFLP）技術已經成功的應用于土壤微生物群落的分析[12-14]。采用T-RFLP技術可以分析群落間差異，比較群落相對豐度和結構，識別群落中具體物種[15]。以往關于鎘污染土壤施用鈍化劑的研究主要是關注施用鈍化劑后對土壤中鎘的植物有效性以及植物對鎘的吸收和累積等方面，而有關土壤微生物和酶活性對施用鈍化劑的響應等方面的研究較為缺乏。本研究在課題組前期研究的基礎上，重點探討鎘污染稻田儲備性施用鈍化劑后土壤微生物對其的響應，研究結果可為鈍化改良措施的風險評估提供數據支撐，并為鎘污染的鈍化修復提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

田間試驗于2007年開始在湖南省某工業城市市郊進行。試驗點因土壤鎘污染，部分農田棄耕，主要污染源為附近的一個小型電鍍廠，該廠已于2006年4月依法關閉。試驗土壤發育于第四紀紅色黏土，其基本理化性質見表1。

表1 供試土壤基本理化性質

試驗以當地習慣種植為對照（CK），設石灰（L，含鎘0.14 mg/kg，按1.5 t/hm2一次性施入）、鈣鎂磷肥（P，含鎘2.1 mg/kg，按22.5 t/hm2一次性施入）、海泡石（S，主成分海泡石和石英，未檢出鎘，按22.5 t/hm2一次性施入）、腐植酸礦粉（H，含鎘0.28 mg/kg，按45 t/hm2一次性施入），共5個處理。每個處理3次重復。單個處理小區面積為20 m2，采用覆塑料薄膜（埋深20 cm）的田埂分隔，隨機區組排列。種植制度為中稻，水稻品種為“金優207”。在第一季水稻移栽前7 d，所有鈍化劑一次性施入，然后人工耙勻，隨后不再施用，按照當地種植習慣進行田間管理。

1.2 樣品采集與測試

2007年施鈍化劑前用不銹鋼土鉆采集各小區耕層土樣，自然風干后分別過1mm和0.15mm尼龍篩，測定土壤的基本理化性質。2009年10月水稻收獲后用不銹鋼土鉆采集各小區耕層土樣，一部分自然風干后分別過1mm和0.15mm尼龍篩，測定土壤pH值、土壤有效態鎘和土壤酶活性；一部分自然風干至含水量約40%，保存于4℃冰箱，用于測定土壤微生物生物量碳（Cmic）和微生物生物量氮（Nmic）。同時在采樣現場將部分土樣立即包裝放入液氮中，回實驗室保存于-70℃冰箱，用于T-RFLP分析。

土壤Cmic用氯仿熏蒸、0.5 mol/L K2SO4提取，TOC-500自動分析儀測定[16]；土壤Nmic用氯仿熏蒸、0.5 mol/L K2SO4提取，流動注射分析儀測定[17]；土壤脲酶活性用苯酚鈉比色法測定，磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法測定，過氧化氫酶活性用高錳酸鉀滴定法測定[18-19]。采用SDS-GITC-PEG法提取土壤微生物總DNA[20]。DNA的濃度和純度用紫外分光光度計測定（Nanodrop，PeqLab，Germany）。

細菌16SrDNA基因PCR擴增正向引物為8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），反向引物為 926R（5′-CCGTCAATTC（A/C）TTTGAGTTT-3′），其中正向引物 5′端用6-羧基二乙酸熒光素（FAM）標記。50 μL的PCR反應體系組成如下：10×Taq DNA聚合酶緩沖液5.0 μL，MgCl22.5 mmol/L，dNTPs（each）0.2 mmol/L，正向和反向引物各 0.4 μmol/L，模板DNA100 ng，DNA聚合酶 Taq1（TaKaRa）1 U，ddH2O補水至 50 μL。PCR反應條件如下：95℃，5 min；40個循環為：(95 ℃，30 s；56 ℃，45 s；72 ℃，1 min)；72 ℃延伸10min。真菌ITS片段基因PCR擴增正向引物為ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′），反向引物為 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），其中正向引物 5′端用6-羧基二乙酸熒光素（FAM）標記。50 μL的PCR反應體系組成如下：10×Taq DNA聚合酶緩沖液5.0 μL，MgCl22.5 mmol/L，dNTPs（each）0.2 mmol/L，正向和反向引物各0.4 μmol/L，模板 DNA100 ng，DNA 聚合酶 Taq1（TaKaRa）1U，ddH2O補水至 50 μL。PCR 反應條件如下：95℃，5 min；40個循環為：(95 ℃，30 s；52 ℃，45 s；72 ℃，1 min)；72 ℃延伸10 min。

擴增的PCR產物用PCR純化試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，中國）純化，方法按說明進行。純化后的細菌和真菌產物分別用HhaⅠ和TagⅠ消化，反應體系50 μL，限制性內切酶 20U，10×buffer 5 μL，DNA 300 ng，ddH2O 補水至50 μL。37℃下酶切反應2 h，65℃下水浴10 min終止酶切反應。酶切產物送至上海桑尼生物技術有限公司進行自動測序分析（Model373A，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany）。

1.3 數據分析

T-RFLP圖譜中每一個限制性片段（T-RF）作為一個OTU（operational taxonomic unit），T-RF片段大小±1 bp是同一個OTU，其豐度按照Thomas的方法計算[14]，即以相對峰高值 (每個T-RF的峰高除以累計峰高值)作為OTU豐度，相對誤差不超過10%。T-RFLP圖譜中限制性片段（T-RF）范圍在35 bp～550 bp，熒光值閾值超過100RFU，在平行實驗的圖譜中重復再現的峰納入統計分析，片段相對豐度超過總T-RF豐度的10%定義為該樣品細菌和真菌的優勢種群。

采用Shannon多樣性指數（Shannon Diversity，H）：H＝-Σ（pi）（Inpi）和均勻度指數（Evenness index，E）：E=H/Hmax（其中Hmax=lnS）進行土壤真菌和細菌種群多樣性分析，其中Pi代表屬于某個OUT的個體在全部個體中的比例。

采用ANOVA法（P＜0.05或 P＜0.01，SPSS16.0）進行差異性檢驗；采用Canoca for windows 4.5軟件對細菌和真菌群落進行冗余分析（RDA）。

2 結果與討論

2.1 施用鈍化劑對土壤酶活性和土壤微生物生物量的影響

酶作為土壤的重要活性物質參與了土壤中的各種生化反應，其活性大小可反映土壤的綜合肥力特征與土壤養分轉化進程。由圖1可以看出，不同鈍化劑處理土壤的脲酶（圖1a）和磷酸酶（圖1b）的活性變化區間分別在0.09 mg/g·h～0.23 mg/g·h和 1.83 PNP mg/g·h～ 3.16 PNP mg/g·h之間，但各處理間的差異均未達到顯著水平。施用海泡石顯著提高了土壤過氧化氫酶的活性（與CK相比提高19.0%，P＜0.05），其他處理對過氧化氫酶活性未產生顯著影響（圖1c）。Lee等研究施用鈍化劑修復礦山污染土壤重金屬時發現，施用鈍化劑顯著降低了土壤重金屬的有效性，進而引起土壤脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶活性等土壤微生物性狀的改善[21]。前期研究結果表明施用鈍化劑顯著降低了土壤鎘的有效性[7]，但對土壤脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶活性的影響有限，這可能是因為本研究的土壤鎘污染程度相對較低，鎘有效性降低對酶活性的影響有限所致。有研究指出，土壤pH值降低可能是導致過氧化氫酶活性降低的原因[22]，在本研究中，海泡石處理顯著提高了土壤pH值[7]，可能是其過氧化氫酶活性提高的主要原因。

圖1 施用鈍化劑對土壤脲酶（a）、磷酸酶（b）、過氧化氫酶（c）、微生物生物量（d）的影響

土壤微生物生物量是反映土壤環境質量的重要微生物學參數，對人為活動、重金屬污染等外界條件的變化反應比較敏感。由圖1（d）可以看出，施用鈍化劑后土壤Cmic呈升高趨勢，但處理間差異并未達到顯著水平，這與前人的研究結果是一致的[23，24]。然而，施用石灰和腐植酸礦粉后土壤Nmic顯著降低，降低幅度分別為33.0%和33.8%，施用鈣鎂磷肥則使土壤Nmic顯著提高（增幅44.9%）。進一步分析發現，施用石灰和腐植酸礦粉顯著提高了Cmic/Nmic，而施用鈣鎂磷肥則顯著降低了Cmic/Nmic。這表明供試4種鈍化劑在修復鎘污染稻田過程中，雖然對土壤微生物生物量影響有限，但可能改變了土壤微生物種群結構。

2.2 施用鈍化劑對土壤微生物種群結構的影響

由于核苷酸序列具有多態性，所以同一個基因的DNA片段在相同的酶切后可能得到長度不同的T-RF，通過對T-RF以及由此生成的T-RFLP圖譜的分析，可以揭示樣品中微生物的種類和數量等信息，從而解析微生物群落的結構及其動態變化[25]。大多數情況下，可以粗略的認為每個T-RF對應著一個微生物物種。利用限制性內切酶Hha I和Taq I酶切的T-RFLP圖譜，根據末端限制性片斷的數目及其豐度，分別計算了不同鈍化劑處理稻田土壤細菌、真菌香農指數（Shannon）和均勻度指數（Evenness）。結果表明（表 2），細菌Shannon指數介于3.83～4.23之間，Evenness指數介于0.85～0.96之間；真菌Shannon指數介于4.11～4.48之間，Evenness指數介于0.79～0.94之間。施用鈍化劑后的土壤細菌和真菌Shannon指數和Evenness指數均呈降低趨勢，其中海泡石和腐植酸礦粉處理的真菌Shannon指數顯著低于對照，海泡石、腐植酸礦粉和鈣鎂磷肥處理的Evenness指數顯著低于對照。可見，施用鈍化劑顯著降低了土壤真菌的多樣性。

表2 鈍化劑對鎘污染稻田土壤細菌和真菌多樣性的影響

用Hha I和Tag I酶切細菌和真菌DNA后分別檢測到21和27個相對豐度大于1%的T-RF（圖2）。由圖2a可知，施用鈍化劑后土壤細菌的T-RF均出現了新增片段，其相對豐度占總T－RF的比例在18%～30%之間，雖然未出現原有T-RF的缺失，但其相對豐度都有不同程度的降低，如36bp、92bp、59bp和106bp等。由圖2b可知，施用鈍化劑后真菌缺失了部分T-RF（52bp、55bp、270bp等），同時新增了部分T-RF，其相對豐度占總T-RF的比例在9%～31%之間。由此可見，鈍化劑儲備性施用修復鎘污染稻田使土壤細菌和真菌種群結構均發生明顯變化，這也驗證了土壤微生物生物量變化的結果。Karaca等發現添加50 mg/kg鎘培育的污染土壤（砂壤土）施用污泥和磷肥后，細菌和假單胞菌的種群豐度顯著提高[26]。還有研究發現，在鉛、鎘和鋅復合污染酸性土壤上施用紅泥、石灰和沸石能夠有效提高土壤微生物種群豐度（Biolog法）[27]。這與本研究的結果不同，可能因為其研究的土壤重金屬污染程度極高，重金屬對土壤微生物的毒害作用更強，施用鈍化劑后重金屬有效性顯著降低，進而改善了土壤微生物性狀。重金屬污染程度相對較輕的土壤（如本試驗）施用鈍化劑后對土壤微生物性狀的改善作用可能相對較弱。Mench等研究也表明鎘、鎳污染程度不高的土壤采用棕閃巖和鐵砂作為鈍化劑，對細菌豐度無顯著影響[24]。

圖2 鈍化劑對鎘污染稻田土壤細菌(a)、真菌(b)T-RF相對豐度的影響

2.3 環境因素對土壤細菌和真菌分布的影響

通過冗余分析（Canoco4.5軟件）土壤細菌和真菌群落結構與土壤環境因子間的關系，探討了施用鈍化劑對土壤細菌和真菌群落結構產生影響的機理。結果表明，有效態鎘和pH值顯著影響土壤細菌群落（圖3a，P值分別為0.002和0.032），Nmic、pH值和有效態鎘顯著影響土壤真菌群落（圖3b，P值分別為0.002、0.002、0.008）。我們前期的研究結果表明，石灰、鈣鎂磷肥、海泡石和腐植酸礦粉主要通過提高土壤pH值，進而降低土壤中鎘的有效性的。由此可見，土壤pH值變化可能是引起土壤細菌和真菌群落結構發生變化的原因。李江濤等[28]也發現土壤pH值變化是真菌群落的主要影響因素；袁紅朝等[29]的研究結果表明，土壤pH值變化會導致土壤中對環境變化敏感的細菌種群豐度發生變化。

3 結論

通過田間小區試驗研究發現，儲備性施用鈍化劑修復鎘污染稻田，對土壤微生物生物量碳和脲酶、磷酸酶及過氧化氫酶活性的影響較小，但施用石灰和海泡石使土壤Nmic顯著降低，而施用鈣鎂磷肥使Nmic則顯著提高；T-RFLP的分析結果顯示，鈍化劑儲備性施用使土壤T-RF的豐度發生了顯著變化，出現部分T-RF的缺失和新T-RF的產生，土壤細菌和真菌的多樣性指數均呈降低趨勢，這表明施用鈍化劑修復鎘污染稻田顯著改變了土壤細菌和真菌的種群結構，土壤pH值是影響細菌和真菌群落組成的主要因素。然而，施用鈍化劑后缺失的T－RF和新增的T－RF對應的真菌和細菌種類尚不清楚，其功能也未知，需要進一步開展研究。

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