豬圓環病毒2型ORF3基因的克隆及原核表達

楊曉燕，劉 航，楊順利，尹雙輝，尚佑軍，田永強

（1.蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046）

豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）是目前發現的最小的動物病毒[1]，屬于圓環病毒科（Circoviridae）圓環病毒屬（Circovirus），病毒基因組為無囊膜的單股環狀DNA病毒。病毒顆粒平均直徑為17nm，呈20面體對稱[2]。根據PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，將PCV分為PCV1和PCV2兩個基因型，基因組大小約為1.7kb，其中PCV1對豬為非致病性，但廣泛存在豬體內及豬源代細胞系。PCV2感染常常被認為可引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）、皮炎腎病綜合征、增生性壞死性肺炎、豬繁殖與呼吸綜合征、仔豬傳染性先天性震顫等多種疾病，但臨床上以PMWS最為常見[3-5]。

PCV2的ORF3基因是除ORF1、ORF2外較大的閱讀框[6]，位于基因組671～357 bp位堿基(復制起始點作為序列起始)，大小為314 bp，編碼104個氨基酸。ORF3對應著ORF1（Rep蛋白氨基酸103～207 aa）的反向互補序列和Cap蛋白B淋巴細胞抗原表位（185～211 aa），與ORF2蛋白的一個 T淋巴細胞抗原表位共用201～211 aa，功能尚不完全清楚[8]。而其他閱讀框編碼產物的功能和特性目前尚不清楚。為了探討ORF3基因結構及其與功能的關系，研究以實驗室分離的PCV2菌株為材料，對ORF3基因進行完整克隆，并在大腸桿菌中克隆表達。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株與基因

實驗室保存的從臨床表現為PMWS仔豬脾臟中分離的PCV2毒株；大腸桿菌 JM109，BL21（DE3）菌株，載體 pGEX-6p-1（Invitrogen公司）。

1.2 酶與試劑

引物、PCR試劑、DNA片段回收試劑盒、質粒提取試劑盒（大連寶生物有限公司）；T4 DNA連接酶、BamH I、Sal I限制性內切酶，Taq酶（promega公司）；核酸 Makers，蛋白 Makers，TMB，辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG抗體（Sigma公司），其他試劑均為國產分析純試劑。

1.3 引物設計與目的基因的PCR擴增

按照Genbank中PCV2 ORF3的序列，設計一對特異性引物，引物序列如下：

P1：5′-TTCGGATCCATGGTAACCGTCCCACCACT-3′

P2： 5′-CTGGTCGACCCTGATGGAATGTGGAGC-3′

為了便于克隆，在引物P1中加入了BamH I酶切位點，在P2中加入了Sal I酶切位點，同時為了方便表達及表達產物的純化，刪去了終止密碼子，引物由上海生工合成。PCR擴增反應條件：95℃5 min，94℃變性 1 min，55℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，循環30次后，最后72℃延伸10 min。擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，用DNA回收試劑盒回收PCR產物。

1.4 原核表達載體的構建

將回收的PCV2 ORF3基因片段與載體pGEX-6p-1分別用BamH I+Sal I雙酶切，用T4 DNA連接酶將ORF3克隆到載體pGEX-6p-1中。連接產物轉化入大腸桿菌JM109感受態細胞，經BamH I+Sal I雙酶切及PCR鑒定，篩選出重組質粒，命名為pGEX-6p-1-ORF3。將重組質粒pGEX-6p-1-ORF3送上海生工進行測序。

1.5 ORF3基因的誘導表達及其可溶性分析

將重組質粒pGEX-6p-1-ORF3轉化大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，將含有重組質粒的單菌落在新鮮的 5mL LB 培養基（含 100 μg/mL，Amp+），37℃振蕩培養過夜（180 r/min），陰性對照為含空白載體pGEX-6p-1的受體菌。次日按1%的接種量將重組菌pGEX-6p-1-ORF3接種到新鮮的含Amp+的LB培養基中，37℃培養至OD600值約為0.6～0.8左右時，取1 mL作為未誘導樣品，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至終濃度1 mmol/L，37℃誘導表達8 h，收集1 mL菌液，用120 g/L分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

將BL21轉化菌進行誘導表達后，收獲菌體進行超聲波破碎，離心分離后分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，檢測目的蛋白的可溶性。

1.6 Western-blot鑒定

將SDS-PAGE凝膠的蛋白帶電轉移至硝酸纖維素膜，以封閉液（TBST+1%BSA）封閉過夜，與PCV2陽性豬多抗血清37℃溫浴1 h，經充分洗滌后，再轉入封閉液稀釋的HRP標記羊抗豬IgG中，37℃溫浴1 h，DAB顯色。

2 結果與分析

2.1 ORF3的擴增及重組質粒鑒定

用P1/P2引物進行擴增，得到大小約為314 bp的片段（如圖1）。大小與預期結果相符。將該片段與經雙酶切作用后的原核載體pGEX-6p-1連接后，連接產物轉化入大腸桿菌JM109感受態細胞，經BamH I+Sal I雙酶切及PCR鑒定，出現約314 bp大小的片段（圖2、圖3）。經測序，結果表明所連序列即為目的序列。

圖1 ORF3基因的PCR擴增

圖2 重組質粒pGEX-6p-1-ORF3的PCR鑒定

圖3 重組質粒pGEX-6p-1-ORF3的酶切鑒定

2.2 PCV2 pGEX-6p-1-ORF3的誘導表達、分析

通過SDS-PAGE電泳分析在E.coli中重組蛋白pGEX-6p-1-ORF3大小約為37 kD（pGEX-6p-1載體所帶的GST標簽大小為26 kD）（如圖4），在37℃條件下表達的pGEX-6p-1-ORF3主要以包涵體形式存在。進一步調整誘導條件，降低誘導溫度、IPTG濃度、延長誘導表達的時間，但仍是大部分以包涵體形式存在，對包涵體進行純化，如圖5所示。

圖4 pGEX-6p-1-ORF3表達產物的SDS-PAGE檢測

圖5 pGEX-6p-1-ORF3表達產物可溶性鑒定和純化

2.3 pGEX-6p-1-ORF3表達產物的Western blot鑒定

重組蛋白pGEX-6p-1-ORF3與抗PCV2的豬血清相互作用后，利用化學底物進行顯色，可以觀察到明顯的特異性蛋白條帶（圖6），重組蛋白pGEX-6p-1-ORF3能夠和PCV2陽性血清發生特異性相互作用，說明其與天然的ORF3蛋白一樣，具有作為候選抗原應該具有兩種特征之一，即反應原性。

圖6 重組蛋白pGEX-6p-1-ORF3的Western blot檢測

3 討 論

ORF3蛋白是新發現的PCV2非結構蛋白，是近年來的研究熱點。位于基因組互補鏈上，ORF1基因的內部，方向與ORF1基因相反[6]。Liu等采用點突變技術使PCV2 ORF3基因功能缺失，并用缺失ORF3功能的PCV2進行 PK-15細胞的感染試驗以驗證ORF3的功能，表明ORF3編碼蛋白是在病毒復制中屬非必需的蛋白，它是通過誘導細胞凋亡從而在致病性方面發揮作用。其他試驗也表明，ORF3編碼蛋白與 PCV2的致病性也有一定的關系，由ORF3編碼的蛋白可以影響病毒衣殼蛋白在機體內的免疫效果[9]。ORF3蛋白的缺失或變異均能減弱PCV2的致病。

研究成功構建了重組質粒pGEX-6p-1-ORF3，并在大腸桿菌中誘導表達，但重組蛋白以包涵體的形式存在，需要變性、濃縮并復性。為此，本研究用Ni2N TA蛋白純化試劑盒（QIA GEN公司），對目的蛋白進行了純化、濃縮，濃縮后的蛋白濃度可達6.11 mg/mL，該質量濃度完全能滿足后續試驗需要。為了恢復重組蛋白的免疫學活性，研究利用蛋白復性試劑盒proteinrefolding kit（Novagen公司）對其進行透析復性，Western blot檢測結果表明，經純化復性的重組蛋白能夠特異性的結合PCV2多克隆抗體，表明目的蛋白具有與PCV2相同的抗原性，可用于PCV2 ORF3單克隆抗體及PCV2的ELISA檢測方法研究。試驗通過PCR擴增得到了ORF3基因，并將其連接到了表達載體pGEX-6p-1上，得到了陽性表達質粒pGEX-6p-1-ORF3，將其轉化入大腸桿菌BL21（DE3）中，但未獲大量融合表達，重組蛋白以包涵體形式存在，免疫印記試驗均證實重組表達蛋白具有良好的反應原性，命名為pGEX-6p-1-ORF3，為進一步研究ORF3蛋白的生物活性、功能及對PCV2致病機理的影響奠定了基礎。

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